Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
линейной скорости и вклад в суммарное уравнение отдельных его членов,
характеризующих размывание хроматографической зоны. Кривая,
демонстрирующая их суммарное влияние, показывает, что h зависит от
объемной скорости и что минимальное значение h может быть достигнуто при
примерно равных вкладах второго и третьего членов уравнения (24). К числу
основных параметров, контролирующих высоту, эквивалентную теоретической
тарелке, относятся: объемная скорость, диаметр частиц сорбента (длина
диффузионного пути), характер заполнения колонки, геометрия заполнения и
коэффициент диффузии. Эти параметры, называемые кинетическими, определяют
положение кривой h-и н ступенчатый вид правой ее ветви; они будут
подробно рассмотрены в гл. 2.
2-1189
18
Глава 1
1.5. Разрешение
Оптимизация хроматографического процесса в целом должна предусматривать
как улучшение разделения компонентов смеси [в соответствии с уравнением
(13)], так и уменьшение размывания зон [см. уравнения (16) и (24)].
Параметр, учитывающий оба эти требования, служит критерием достигнутой
оптимизации хроматографического процесса. Его называют разрешением Rs и
определяют как отношение расстояния между максимумами двух соседних пиков
к среднему арифметическому их ширины по нулевой линии:
/?5 = 2(/д2-Iri) / {W\-\-W2) (25)
При полном разрешении пиков Rs= 1 (см. рис. 1.2). Для гауссовых пиков (са
= 4а) равной высоты с пренебрежимо малой разностью в их стандартных
отклонениях (01=02 или wi = w2) уравнение (25) выглядит следующим
образом:
Rs = (*"2-?ri)/4 Ot (26)
Подставляя в уравнение (26) выражения (12) и (18), получим
tfs=(l/4) (k2-ki)/(/?2"f"&\)~jn (27)
чаем уравнение разрешения в окончательном его виде:
(at для пика 2 в единицах времени).
Преобразуя уравнение (27) с учетом уравнения (11), полу-
----^-Уп (28)
4 a k + 1
В это уравнение входят три переменные, определяющие основные требования к
разрешению: разделяемые вещества должны удерживаться на неподвижной фазе,
т. е. /г>0; удерживание разделяемых веществ должно различаться, т.
е. а>1; хроматографическая колонка должна характеризоваться
определенным
числом теоретических тарелок.
При замене числа теоретических тарелок п в уравнении (28) на число
эффективных теоретических тарелок N в соответствии с уравнением (21)
имеем
= - ^ZLLyjj (29)
4 а
Подбирая условия для проведения хроматографического разделения, этими
тремя переменными, входящими в уравнение (28), вполне можно варьировать,
но в определенных пределах. Улучшение разрешения путем увеличения
коэффициента емкости имеет два следующих ограничения. Во-первых, как
следует из уравнения (6), с ростом k увеличивается время удерживания и,
следовательно, длительность анализа. Во-вторых, как показы-
Основы теории и основные понятия хроматографии
к
вает рис. 1.4, отношение /г/(&+1) очень скоро достигает своей
предельной величины, равной единице. При k>5 разрешение' увеличивается
очень слабо. На практике это означает, что необходимо выбирать такие
условия разделения, чтобы коэффициент емкости находился в пределах от 1
до 5. Максимальное число эффективных теоретических тарелок в единицу
времени достигается при k - 2.
Ключевую роль в данной ситуации играет коэффициент разделения а,
который необходимо предельно увеличить при помощи соответствующего выбора
подвижной и неподвижной фаз и условий разделения. Примерно 50%
публикуемых в последние годы работ в области ВЭЖХ посвящены именно этой
проблеме. Важное достоинство жидкостной хроматографии состоит как раз в
том, что коэффициент емкости и коэффициент разделения относительно
несложно изменить путем изменения состава подвижной фазы (в этом и
заключается основное преимущество жидкостной хроматографии перед
газовой). Следует, однако, заметить, что многие соединения в условиях
хроматографического разделения ведут себя аналогичным образом и,
следовательно, характеризуются малыми значениями а и что разделение
чрезвычайно сложных смесей близких по свойствам соединений приходится
проводить довольно часто.
Согласно уравнению (28), число тарелок должно соответствовать
некоторому определенному минимальному значению.
На рис. 1.5 приведена зависимость коэффициента разделения при i?s=l и
/г= 1 от числа теоретических тарелок. Как показывает эта зависимость,
чтобы достичь значения а<1,1, необходимо использовать колонку с очень
большим числом теоретических тарелок.
2*
50 Глава 1
Коэффициент разделения
Проводя оптимизацию хроматографического разделения, в первую очередь
необходимо подобрать такие условия, которые позволили бы получить высокие
коэффициенты разделения, полностью исключающие какие-либо взаимодействия
между растворенными веществами и подвижной фазой. В различных видах
