Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Исследования необходимо проводить в высоком вакууме; это обеспечивает минимальное столкновение исследуемых ионов с молекулами газа, что уменьшает потери ионов и предотвращает образование побочных продуктов.
Очень важным фактором для масс-спектрометрического исследования соединения является давление его паров при температуре ионного источника. Если соединение при 100—200°С имеет давление паров около 1,3 Па, его можно поместить в резервуар, связанный с ионизационной камерой. Из-за разности давлений между парами образца в резервуаре и ионизационной камере (в ней поддерживается вакуум ~10'5 Па) молекулы образца через небольшую диафрагму поступают в ионизационную камеру.
Образцы малолетучих веществ иногда помещают непосредственно в ионизационную камеру на кварцевой подложке и испаряют их.
Органические молекулы обычно ионизуют, бомбардируя их пучком электронов в вакууме (электронная бомбардировка). Можно ионизовать вещество, поместив его в сильное электрическое поле (полевая ионизация) или облучая ультрафиолетовым светом (фотоионизация),
7*
180 Часть III. Аналитические методы
Рис. 5.13. Схема устройства масс-спектрометра.
1 — резервуар с парами образца; 2 — твердый образец; 3 — ионизационная камера; 4 — к вакуумному насосу; 5 — электростатическое поле; 6 — траектория иона; 7 — магнит; 8 — детектор; 9 — усилитель; 10 — самописец.
Разделение ионов в анализаторе в соответствии с величинами их mle происходит следующим образом. Сначала ионы ускоряются в вакууме с помощью ряда отрицательно заряженных пластин, а затем попадают в магнитное поле, где отклоняются от своей первоначальной траектории. Для ионов, имеющих одинаковый заряд, отклонение зависит только от массы, поэтому легкие ионы отклоняются сильнее. Меняя напряженность магнитного поля или ускоряющего электрического поля, мы тем самым меняем траекторию ионов, и таким образом на щель детектора попадают ионы с определенной-величиной m/е. Число регистрируемых детектором ионов зависит от количества образовавшихся ионов данного сорта.
Детектором чбычно служит простой электрод (чаша Фарадея) или электронный умножитель. Ионный ток затем усиливается и регистрируется. Поскольку один масс-спектр содержит целый набор пиков сильно различающейся интенсивности, спектры регистрируют с разной чувствительностью, меняющейся обычно в 300 раз. Такой способ обеспечивает наиболее точную регистрацию всех пиков.
Способность масс-спектрометра разделять два иона с мало различающимися массами тх и т2 называется разрешающей способностью-, она равна mj(m2—mj). Разрешающая способность зависит от размера щели детектора, но, сильно уменьшая щель, мы тем самым снижаем чувствительность установки, поскольку уменьша-
Гл. 5. Спектроскопические методы 181
ется количество попадающих на детектор ионов. Спектрометры с двойной-фокусировкой имеют разрешение 10е, а однофокусирующие не превышают 104.
5.9.3. Применение
Впервые масс-спектрометрия в биохимии была применена для изучения метаболических процессов. Вещества, меченные с помощью необычных изотопов, например 16N или 180, вводили в рацион животных и затем исследовали конечные продукты их метаболизма. Сравнивая непосредственно интенсивности спектров самих метаболитов, содержащих обычный и необычный изотопы, или продуктов их деградации, например Н21вО и Н21вО, определяли относительное содержание изотопа (отношение количества необычного изотопа к обычному) в различных продуктах метаболизма. В такой методике обычно применяют изотопы 16N и 180. В тех случаях, когда это возможно, метаболические процессы, однако, лучше исследовать более простым и дешевым способом — с помощью радиоактивных изотопов, например 14С, 3Н, 32Р (гл. 6).
В биохимии, как и в физической химии, масс-спектрометрия применяется в основном для определения структуры молекул и, следовательно, идентификации веществ, т. е. для качественного анализа относительно сложных органических молекул. Зная точный молекулярный вес органической молекулы, можно определить ее элементарный состав, имея таблицы точных масс атомов. Таким образом, структура простых молекулярных ионов может быть определена просто из его массы, а структура более сложных органических молекул, таких , как стероиды, убихиноны, триглицериды,— из анализа их осколочных ионов.
Для правильной интерпретации данных по масс-спектрометрии очень важно, чтобы исследуемое вещество было чистым, поэтому целесообразно объединять масс-спектрометр с газожидкостным хроматографом (разд. 3.5.11). Смесь веществ подают на хроматограф, где эти вещества разделяются, а затем поступают в масс-спектрометр. Для такого анализа необходимы быстро сканирующие спектрометры, например диапазон mle 10—103 должен регистрироваться за 2—5 с. В этом случае удается регистрировать образцы, плохо разделяемые хроматографически, снимая масс-спектры первых и последних фракций несимметричного пика. Объединяя масс-спектрометрию с газожидкостной хроматографией, удается получить отличные масс-спектры вещества, когда количество его составляет всего 10~7 г. Поток вещества в ионизационную камеру не должен превышать 1 мм3-с-1, поскольку в ней должен поддерживаться высокий вакуум. Поэтому перед введением хроматографических фракций в масс-спектрометр удаляют газ-носитель при помощи диффузии через мелкопористую перегородку.
