Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
182 Часть III. Аналитические методы
В настоящее время масс-спектрометры применяются для анализа последовательности аминокислот в олигопептидах, получающихся в результате гидролиза белков или другим путем. Для повышения летучести пептиды ацетилируют и метилируют. Пептидные связи легко расщепляются при бомбардировке их электронами, причем фрагментация идет с С-конца пептидов. Поскольку все аминокислоты имеют разный молекулярный вес, то по разнице в массах, соответствующих двум соседним основным пикам на спектре, сразу же идентифицируется С-концевая аминокислота более тяжелого фрагмента. Для определения аминокислотной последовательности исходного иона по разнице между основными пиками на масс-спектрах применяются ЭВМ и составлены соответствующие программы. В настоящее время для такого анализа аминокислотной последовательности белков лимитирующей является стадия фракционирования гидролизата белка на отдельные олигопептиды.
5.10. Сводная таблица спектроскопических методов
Тип
. Используемый принцип
Область применения
Спектрофотомет-рия в видимой и ультрафиолетовой области
Спектрофлуоримет-
рия
Инфракрасная спектроскопия и и спектроскопия комбинационного рассеяния Пламенная спект-ро фотометрия {эмиссия и абсорбция)
Энергетические переходы связанных и несвязанных внешних электронов, в молекулах. Обычно это делокализован-ные электроны
Испускание света, длина волны которого больше длины волны поглощенного света
Колебания атомов в молекуле, приводящие к изменению дипольного момента и поляризуемости соответственно Энергетические переходы внешних электронов атомов после испарения вещества в пламени
Обычный качественный и количественный биохимический анализ, включая многочисленные •> колориметрические исследования. Количественные определения ферментов и кинетические исследования. Разностные спектры, спектры действия, турбидиметрия и нефелометрия Обычный количественный анализ, исследование свойств ферментов, кинетики реакций, конформационной подвижности полимеров. Большая по сравнению со спектрофо-тометрией чувствительность. Качественный анализ Качественный анализ. Идентификация молекул среднего размера по спектрам. В основном применяется в исследовательских целях Качественное и количественное определение металлов, особенно в клинической биохимии. Эмиссионная методика:
Гл. 5. Спектроскопические методы 183
Тип
Используете принцип
Область применения
ЭПР-спектромет-
рия
ЯМР-спектромет-
рия
Масс-спектромет-
рия
Регистрация магнитных моментов неспаренных электронов
Регистрация магнитных моментов ядер с нечетным числом протонов
Определение количества положительно ионизованных молекул и их фрагментов
простое определение щелочных металлов. Абсорбционная методика расширяет диапазон определяемых металлов и’^обладает большой чувствительностью
Исследование металлсодержащих белков, особенно метал-лоферментов, и изменений в окружении свободных радикалов, введенных в биологические объекты, например мембраны
Исследование структуры органических молекул, имеющих мол. вес не более 20000
Количественный анализ малых количеств вещества (10-в— —1(Г» г). Удобно использовать в сочетании с газожидкостной хроматографией.
В основном используется в исследовательских целях, но имеется принципиальная возможность определения последовательности аминокислот в белках
5.11. Рекомендуемая литература
Browning D. R., Spectroscopy, McGraw-Hill, London, 1969. (Исчерпывающий обзор всех рассмотренных в этой главе методов — принципов, на которых они основаны, оборудования и химического приложения.)
Caspersson Т., Lornakke G., Instrumentation in Biochemistry (Goodwin T.W., ed.), Biochem. Soc. Symp., 26, 25—40. Academic Press, London (1966). (Обзор по микроколичественным спектрофотометрическим мето-' дам.)
Cotowick S. P., Kaplan N.O. (eds.) Preparation and assay of substrates/Methods in Enzymology, 3, Academic Press, New York (1957). (Методика проведения колориметрических измерений.)
Ftorkin M.,Stotz E.H. (eds.). Methods for the study of molecules. Comprehensive Biochemistry, 3, Elsevier, Amsterdam (1967). (Обзор всех рассм отрен-ных в этой главе методов.)
Knowles P. F., The Application of Magnetic Resonanse Methods to the Study of Enzyme Structure and Function in Essays Biochem., 8, Academic Press, London (1972). ’
Schwartz H. М., Notion J. R., Borg D. C. Biological Application of Electron
184 Часть III. Аналитические методы
Spin Resonanse, Wiley-Interscience, New York (1972). (Принципиальная основа и применение ЭПР).
Udenfreud S., Fluorescense Assays in Biology and Medicine, v. 1 and 2, Academic Press, London (1969).
Дополнительная литература '
Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот, под ред.
Ю. Лазуркина, изд-во «Наука*, М., 1967.
Штерн Э., Тиммонс К-, Электронная абсорбционная спектроскопия в органической химии, пер. с англ., изд-во «Мир», М., 1974.
Юденфренд С., Флуоресцентный анализ в биологии и медицине, пер. с англ., изд-во «Мир», М., 1965.
Глава 6
РАДИОИЗОТОПНЫЕ МЕТОДЫ
