Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
такой длины. Образование шлейфа при разделении продуктов расщепления
свидетельствует о том, что структуры, подобные нуклеосомам, у
марсианского микроорганизма не расположены, как у земных организмов, на
одинаковом расстоянии друг от друга. Если бы в марсианских клетках
нуклеосомы располагались
390 Глава 9
Рис. 9-36. Схема, иллюстрирующая применение метода непрямого ме-чения
концов для анализа фрагментов разной длины, представленных на рис. 9-9,
(ответ 9-10). Участки расщепления микрококковой нуклеазой указаны
стрелками, направленными вниз. Небольшой разрыв посередине фрагментов,
образовавшихся при обработке нуклеазой, представляет собой участок
расщепления ферментом BamHI. Числа означают длину фрагментов,
гибридизующихся с зондом, и соответствуют длинам фрагментов,
представленных на рис. 9-9.
Фрагменты, которые после обработки BamHI не гибридизуются с зондом
50000000 I
">OOOOOOOOOOOOVOOWOO< I $9995й?У5йЛЛЛДЛОЛбООООООООООС I ¦00000000090Q0044
I
ООО<Х><>О0ООО<Х*КЛЛЛ<Ъ^^ I
190
Фрагменты, которые после обработки BamHI гибридизуются с зондом
350
I
600
I
760
I
920
I 1080
¦ I 1240
- I
| Зонд
BamHI
на одинаковом расстоянии друг от друга, то образовалась бы лесенка
полос, аналогичная той, что наблюдается при анализе хроматина из печени
крысы.
9-10
А. При обработке микрококковой нуклеазой образуются фрагменты, длина
которых варьирует в зависимости от протяженности участка между
нуклеосомами (ею определяются концы фрагментов) (рис. 9-36). Поскольку
микрококковая нуклеаза разрезает ДНК не в строго определенных участках
внутри линкерной ДНК, то имеется некоторый разброс в длине фрагментов
даже при расщеплении между двумя одинаковыми парами нуклеосом. Вместе с
тем, при расщеплении нескольких разных пар межнуклеосомных участков могут
образоваться фрагменты одинакового размера. Подобная вариабельность
мешает точно определить порядок расположения соседних нуклеосом. После
обработки BamHI полосы получаются более четкими потому, что в этом случае
один конец каждого фрагмента ДНК точно фиксирован. Как показано на рис.
9-36, лишь фрагменты, лежащие вправо от участка расщепления ферментом
BamHI, гибридизуются с радиоактивным зондом. Полученные результаты легко
интерпретировать, поскольку длина каждого фрагмента прямо соответствует
расстоянию между участком расщепления нуклеазой и участком разрезания
BamHI. В варианте без обработки BamHI оба конца фрагментов определяются
участками расщепления микрококковой нуклеазой. В этом случае нельзя точно
определить положение сайта разрезания по отношению к зонду, поскольку при
расщеплении нуклеазой нескольких пар участков могут образоваться
фрагменты одного размера. Описанный в этой задаче метод картирования
концов, образующихся при обработке нуклеазой, называется методом
непрямого мечения концов, потому что определенный конец (участок
расщепления BamHI) метится косвенным образом - путем гибридизации с
радиоактивно меченным зондом.
Б. Размеры фрагментов указывают на расстояние между участками
расщепления нуклеазой и участком расщепления BamHI (рис. 9-36). Поскольку
микрококковая нуклеаза разрезает ДНК между нуклеосомами, то участки
расщепления позволяют определить расположение нуклеосом относительно
участка расщепления BamHI (рис. 9-37). За исключением области вокруг
центромеры, сайты разрезания расположены с интервалом в 160 нуклеотидов.
Это дает возможность предположить, что нуклеосомы закрывают около 160
нуклеотидов ДНК. Однако участки расщепления по сторонам центромеры
отстоят друг от друга на расстояние 250 нуклеотидов; следовательно,
центромеру закрывает какая-то особая структура (не нуклеосома). Полагают,
что специальные белки связываются
Клеточное ядро 391
Рис. 9-37. Расположение сайтов расщепления микрококковой нуклеазой вокруг
центромеры (ответ 9-10). Нуклеосомы обозначены кружками.
Сайты разрезания микрококковой нуклеазой
1 т.п.н.
с центромерой и защищают ее от
действия нуклеазы. Участки расщепления по сторонам от центромеры
показывают, что между центромерой и соседними нуклеосомами находится
незащищенная ДНК (аналогичная линкерной ДНК между нуклеосомами).
В. Контрольный опыт с очищенной ДНК
нужен потому, что не все последовательности ДНК одинаково чувствительны к
микрококковой нуклеазе. Важно знать чувствительность каждой изучаемой
последовательности ДНК. Иначе можно ошибочно полагать, что появление
специфической полосы объясняется связыванием белка рядом с участком
расщепления, в то время как на самом деле она зависит от специфичности
расщепления нуклеазой. В действительности центромера сама по себе-
предпочтительный участок разрезания (хотя это не показывают результаты по
обработке нуклеазой очищенной ДНК, представленные на рис. 9-9). Тот факт,
что в этом чувствительном участке расщепления не происходит, служит еще
