Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
цепей ДНК перед секвенированием.
Б. Почему отщепление Т-остатков в отсутствие dTTP требует больше
времени, чем отщепление С-остатков?
В. Почему в присутствии dTTP отщепления Т-остатков не происходит, а С-
остатки отщепляются независимо от того, есть ли в реакционной смеси dTTP?
Г. Можно ли ожидать изменения результатов, представленных на рис. 5-
18, Б, если добавить dCTP и dTTP?
5-25 Где образуется РНК-затравка, на специфических или на случайных
участках матрицы? Идеальной матрицей при изучении этого вопроса может
служить ДНК вируса М13, потому что она не содержит З'-ОН-группы.
Для ответа на данный вопрос кольцевую ДНК этого вируса полностью
копировали в присутствии ДНК-полимеразы бактериофага Т4, праймосомы Т4
(комплекс геликазы и РНК-праймазы), различных rNTP
(рибонуклеозидтрифосфатов) и dNTP (дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов).
Затем двухцепочечные кольцевые продукты обрабатывали рестриктазой,
которая расщепляет двойную цепь в специфическом участке. Продукты этого
расщепления подвергали денатурации, после чего анализировали
последовательность нуклеотидов ДНК методом гель-электрофореза с высоким
разрешением. Было обнаружено много отдельных полос. Если продукты
расщепления до электрофореза обрабатывали РНКазой, то все они становились
на пять нуклеотидов короче,
о чем свидетельствовала более быстрая миграция их в секвени-рующем
геле.
Зная, что каждый продукт рестрикции заканчивается специфическим
участком рестрикции, можно было по длине продукта установить матричную
последовательность вблизи 5'-конца. (Полная последовательность М13
известна.) Некоторые из этих матричных последовательностей показаны на
рис. 5-19 слева. Последовательность ДНК на каждом из соответствующих 5'-
концов цепей продуктов была определена после удаления РНК-затравки. Эти
последовательности показаны на рис. 5-19, справа, в той же строчке, что и
комплементарная последовательность матричной ДНК.
Определите на основе этих данных стартовый участок для РНК-
затравки на каждой матричной последовательности. Какой сигнал нужен для
начала реакции, катализируемой РНК-прай-мазой?
5-26 Ген dnaB у Е. coli кодирует геликазу, которая участвует в
расплетании ДНК на участке репликативной вилки. Свойства этого фермента
были изучены с использованием искусственных суб-
Сайт Матричные Последовательности ДНК,
последовательности М13 связанные
с РНК-затравкой
5' 3' 5' 3*
1 А Т С С Т Т G с G Т т G А А А Т А G G А Т
2 Т С т т G т т т G С т с С А G А С А А G А
3 А т т с Т с т т G т т т G С Т С А G А А Т
4 А с А т G с т А G т т т Т А С G С А Т G Т
5 А т т G А с А т G с т А G Т т Т Т С А А Т
6 А т с т Т с С т G т т т Т т G G А А G А т
7 А А А т А т т т G с т т А т А С Т А Т Т т
8 С Т А G А А с G G т т А С с С Т Т С Т А G
26 Глава 5
Область спаренных оснований /
,3*
С
с
Одноцепочечный "хвост" 3,
г- "4.
Рис. 5-20. Субстраты, использованные для определения свойств dnaB (задача
5-26). Л-субстрат 1, Б- субстрат 2, В -субстрат 3.
стратов, подобных тем, которые изображены на рис. 5-20.
Экспериментальный подход заключался в том, что субстраты инкубировали в
разных условиях и затем исследовали образцы методом электрофореза в
агарозных гелях. Короткая одиночная цепь будет двигаться медленно, если
она еще соединена с длинной цепью ДНК, и будет двигаться гораздо быстрее,
если она расплетена и отделена от длинной цепи. Введя в короткую
одиночную цепь радиоактивную метку, можно избирательно следить за ее
миграцией, определяя ее положение в геле методом радиоавтографии.
Результаты нескольких экспериментов показаны на рис. 5-21.
Субстрат 1, представляющий собой гибридную ДНК без "хвостов", не
расплетался с помощью dnaB (рис. 5-21, дорожки 1 и 2). Однако когда
инкубировали субстраты с "хвостами" при + 37 °С в присутствии dnaB и АТР,
то за счет расплетания освобождалось значительное количество мелких
фрагментов (дорожки 6 и 10). В случае субстрата 3 был раскручен только
З'-полуфрагмент (дорожка 10). Процесс расплетания во всех случаях
полностью зависел от гидролиза АТР.
Расплетание существенно увеличивалось при добавлении белка,
связывающегося с одноцепочечной ДНК, (SSB-белок) (сравните дорожки 5 и 6
с 9 и 10). Интересно, что этот белок нужно было добавлять приблизительно
через 3 мин после dnaB, в противном случае он ингибировал расплетание.
A. Почему для расплетания нужен гидролиз АТР?
Б. В каком направлении движется dnaB по длинной одноцепочечной ДНК? С
чем больше согласуется это направление, с движением по ведущей цепи или
