Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
имеющих температурочувствительную мутацию в гене, кодирующем SSB-белок,
рекомбинация и репликация быстро прекращаются при повышении температуры.
Синтезируемый SSB-белок-это мономерный белок удлиненной формы с мол.
массой 35000. Он прочно связывается с одноцепочечной ДНК, но не
взаимодействует с двухцепочечной ДНК. Связывание насыща-
-400 нуклеотидов-
-> -*-100 нуклеотидов-^
-GCTGGTGG '
3 '
" CGACCACC
5'
Хи-сайт
о
30 Г лава 5
recBCD - + + + + +
Кипячение + + + + + ""
Меченый по 5'L 5'L 5'R 3'L 3'R 3'R
Рис. 5-25. Результаты инкубации recBCD-белка с содержащими Хи-сайт
фрагментами ДНК, в которых были помечены концы определенных цепей (задача
5-32). Числа, относящиеся к полосам, указывают длину меченого фрагмента
(в нуклеотидах). Все пробы перед электрофорезом были денатурированы,
кроме пробы 6, которую не подвергали кипячению.
ется при весовом соотношении ДНК:белок, равном 1:12. Для этого
взаимодействия характерна особенность, которая проиллюстрирована на рис.
5-26. При избытке одноцепочечной ДНК (10 мкг) и количестве SSB-белка 0,5
мкг связывания не наблюдается (рис. 5-26, А), тогда как при количестве
SSB-белка 7 мкг происходит почти количественное связывание (рис. 5-26,
Б).
A. Каково отношение числа нуклеотидов одноцепочечной ДНК к числу
молекул SSB-белка при насыщении связывания? (Средняя мол. масса одного
нуклеотида равна 330.)
Б. Контактируют ли соседние мономеры SSB-белка, когда реакция его
связывания с ДНК достигает насыщения? Исходите из того, что при
связывании мономер SSB-белка тянется на 12 нм вдоль молекулы ДНК и что
пространственное расположение оснований в одноцепочечной ДНК после
связывания с SSB-белком остается таким же, как и в двухцепочечной ДНК (т.
е. 10 нуклеотидов на 3,4 нм).
B. Как вы считаете, почему связывание SSB-белка с одноцепочечной ДНК
так сильно зависит от количества SSB-белка, как показано на рис. 5-26?
5-34 Белок гесА катализирует как начальный этап рекомбинации- спаривание,
так и последующую миграцию ветвей у Е. coli. Он способствует
рекомбинации, связываясь с одноцепочечной ДНК и катализируя спаривание
такой покрытой белком цепи с гомологичной двухцепочечной ДНК. Можно
определить действие гесА по образованию кольцевых двухцепочечных ДНК в
смеси из двухцепочечных линейных молекул ДНК и гомологичных им
одноцепочечных кольцевых ДНК, как показано на рис. 5-27. Эта реакция
протекает в два этапа: сначала кольцевая ДНК спаривается с линейной
молекулой на одном из ее концов, а затем точка ветвления продвигается по
линейной двухцепочечной ДНК, пока от нее не отделится линейная
одноцепочечная ДНК.
Для понимания процесса с участием гесА важно знать, происходит
ли перемещение точки ветвления в строго определенном направлении. Этот
вопрос был изучен следующим образом. Одноцепочечные кольцевые молекулы
ДНК, равномерно меченные фосфором 32Р, смешивали с немечеными
двухцепочечными линейными молекулами ДНК в присутствии гесА. Как только
одноцепочечная ДНК спаривается с линейной ДНК, она становится
чувствительной к действию рестриктаз, которые не разрезают одноцепочечную
А 0,5 мкг SSB
Б 7,0 мкг SSB
Рис. 5-26. Связывание SSB-белка фага Т4 с одноцепочечной ДНК (задача 5-
33). Связывание определяли с помощью центрифугирования в градиентах
сахарозы, в которых ДНК, имеющая большую массу, оседает быстрее, чем
белок, и поэтому обнаруживается ближе ко дну пробирки.
*
I
=t
Направление седиментации ¦
+
+
Рис.
цепе!
носп
Одно
( + ) J лине!
( + )-и
Рис. ?
разде.
TOB Кс
с гее/1 карта молек к 3'-к(
Рис. 5-
бинант
Основные генетические механизмы 31
Одноцепочечная кольцевая ДНК
Двухцепочечная линейная ДНК
+
Двухцепочечная кольцевая ДНК с разрывом в одной цели
Одноцепочечная линейная ДНК
+
Рис. 5-27. Метод ассимиляции цепей ДНК для определения активности гесА-
белка (задача 5-34). Одноцепочечная кольцевая ДНК ( + ) комплементарна (-
)-цепи линейного дуплекса и идентична ( + )-цепи этого дуплекса.
Рис. 5-28. Электрофоретическое разделение (А) меченых рестрик-тов как
функция времени инкубации с гесА (задача 5-34). Приведена карта
рестрикции (Б) для кольцевой молекулы; направление от 5'-к З'-концу-по
часовой стрелке.
Рис. 5-29. Родительские и рекомбинантные дуплексы (задача 5-35).
ДНК. Отобрав пробы в разные моменты инкубации, обработав их
рестриктазами и разделив меченые фрагменты с помощью электрофореза,
получили результат, схематично представленный на рис. 5-28.
A. Сравнивая время появления меченых фрагментов с картой рестрикции
кольцевой ДНК на рис. 5-28, сделайте заключение, какой конец (5' или 3')
