Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
мутантов, вы применяете такую дозу облучения, от которой гибнет 99,99%
бактерий. Полученные вами результаты гораздо более однозначны, чем те,
что получил ваш руководитель, использовавший в 10 и 100 раз более высокие
дозы облучения, чтобы достичь такого же уровня гибели бактерий.
Руководитель сомневается в ваших результатах из-за того, что вы всегда
ставите опыты ночью, после его ухода. Когда по настоянию руководителя вы
приходите утром и ставите свои опыты параллельно с ним, у вас обоих
неожиданно получаются совершенно одинаковые результаты. Вы немного
огорчены, потому что полученные данные ближе к результатам вашего
руководителя, а ведь вы самоуверенно полагали, что в экспериментальной
работе более искусны, чем ваш наставник, которого к тому же редко видели
в лабораторном халате в последнее время. Однако когда вы вместе
повторяете эксперименты ночью, то, к удивлению руководителя, результаты
оказываются точно такими, как те, что вы получили раньше.
Теперь, когда утвердилось доверие к результатам друг друга, быстро
появляется ясность. Оказывается, для достижения одного и того же уровня
летального повреждения бактерий в дневное время (в полдень) нужна более
высокая доза ультрафиолетового света, чем утром. В солнечные дни
требуются более высокие дозы, чем в пасмурные. Окна лаборатории выходят
на запад. Попробуйте ответить, какой переменный фактор вносил неясность в
ваши эксперименты?
Такие мутагены, как М-метил-М'-нитро-М-нитрозогуанидин (МННГ) и
метилнитрозомочевина (МНМ), являются мощными метилирующими ДНК агентами.
Они чрезвычайно токсичны для клеток. Нитрозогуанидины применяются в
исследовательской работе в качестве мутагенов, а в клинической практике-
как лекарственные средства при химиотерапии рака, поскольку в первую
очередь они вызывают гибель клеток, находящихся на стадии репликации.
Оригинальный эксперимент, который привел к открытию алки-лирующей
системы репарации у бактерий, был задуман так, чтобы определить
долговременный эффект применения низких доз МННГ (как при химиотерапии) в
сопоставлении с эффектом временного воздействия высоких доз МННГ
(применяемых для мутагенеза). Бактерии помещали сначала в среду с низкой
концентрацией МННГ (1 мкг/мл) на 1,5 ч, а затем переводили в свежую среду
без МННГ. В разные моменты инкубации при низкой концентрации МННГ и после
нее пробы из суспензии бактерий подвергали воздействию МННГ в высокой
концентрации (100 мкг/мл) в течение 5 мин, а затем проверяли на
жизнеспособность и частоту мутаций. На рис. 5-11 хорошо видно, что во
время инкубации в среде с низкой концентрацией МННГ количество выживших
клеток временно увеличивалось и частота мутаций у выживших бактерий
уменьшалась. Как показано на рис. 5-12, этой приспособительной реакции на
низкие дозы МННГ не наблюдалось, если в инкубационную среду был добавлен
хлорамфе-никол (ингибитор синтеза белка).
Основные генетические механизмы 21
Рис. 5-11. Адаптационный ответ Е. coli на низкие дозы мутагена МННГ
(задача 5-18). Мутаген в концентрации 1 мкг/мл присутствовал в среде в
период от - 1,5 до О ч. Пробы отбирали в различные моменты инкубации и
кратковременно обрабатывали их мутагеном в высокой концентрации (100
мкг/мл), после чего оценивали количество выживших клеток и частоту
образования мутантов.
120
.В присутствии МННГ I
После
обработки
МННГ
100
80 -
60 -
40
20
-2
60
во х
о
Ё
40 со х
!?
30
г-
20 I*
10 * <0
Z
0
Время, ч
0 20 40 60
Инкубация с МННГ, мин
Рис. 5-12. Действие хлорамфенико-ла на адаптационный ответ при низких
дозах мутагена МННГ (задача 5-18). После инкубации бактерий в течение
разных периодов времени в присутствии МННГ (1 мкг/мл) отбирали пробы и
обрабатывали их мутагеном в концентрации 100 мкг/мл для определения
чувствительности к мутагену.
А. Связана ли приспособительная реакция Е. coli на низкие уровни МННГ
с активацией уже существующего белка или для нее необходим синтез нового
белка?
Б. Как вы полагаете, почему приспособительная реакция Е. coli на низкую
дозу МННГ является кратковременной?
5-19 Природа мутаций, вызываемых МННГ, а также механизм их удаления из
ДНК были определены в следующих экспериментах. Чтобы выяснить характер
мутагенного повреждения, интактные, а также обработанные низкими дозами
МННГ бактерии инкубировали 10 мин в среде, содержащей меченый мутаген-JH-
МННГ,-в концентрации 50 мкг/мл. Затем из бактерий выделяли ДНК,
гидролизовали ее до нуклеотидов и определяли радиоактивные пурины с
помощью хроматографии на бумаге, как показано на рис. 5-13.
Чтобы выяснить механизм ликвидации мутагенного повреждения, был
сначала выделен и очищен фермент, ответственный за удаление места
повреждения. Кинетику репарации изучали путем инкубации различных
