Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
смешиваете продукты трансляции с высокорадиоактивной ДНК, несущей
энхансер. При анализе этих смесей методом электрофореза в
полиакриламидном геле некоторые из белков, кодируемых клонами кДНК,
связываются с фрагментом ДНК, вызывая замедление его движения в геле
(рис. 10-7, Б, дорожки 3, 4 и 5). Если перед транскрипцией и трансляцией
смешать вместе клоны 3 и 4 кДНК, то в геле появятся три полосы (рис. 10-
7, Б, дорожка 6).
A. Почему запаздывающие полосы находятся в геле на разных уровнях?
Б. Где в молекуле фактора транскрипции расположен домен,
связывающийся с энхансером?
B. Почему при смешивании клонов 3 и 4 кДНК в геле появляются три
запаздывающие полосы? Какой вывод о структуре фактора транскрипции можно
сделать на основе этих данных?
10-13 Когда глюкокортикоидные гормоны присоединяются к рецепторам,
последние меняют свою конформацию, приобретая способность связываться с
ДНК и активировать определенный набор генов. Результаты генетических и
молекулярных исследований говорят о том, что участки связывания с ДНК и
участки связывания с гормонами занимают разные области С-концевой части
глюкокортикоидного рецептора. Присоединение гормона может способствовать
связыванию рецептора с ДНК одним из двух способов: за счет изменения
конформации рецептора и образования в результате этого домена,
связывающегося с ДНК, либо за счет такого изменения конформации, при
котором открывается ранее существовавший ДНК-связывающий домен.
Для анализа этих двух возможностей сопоставляли активности ряда
фрагментов с последовательными делециями у карбоксильного конца (рис. 10-
8). Фрагменты кДНК, соответствующие N-концевой части рецептора,
встраивались в вектор таким образом, что могли экспрессироваться после
трансфекции в соответствующие клетки. Способность фрагментов рецептора
активировать чувствительные к нему гены проверяли в ходе котранс-фекции с
индикаторной плазмидой, несущей чувствительный к глюкокортикоиду элемент,
соединенный с геном хлорамфени-колацетилтрансферазы (САГ). Как показано
на рис. 10-8, реакция
Положение С-конца в мутантных рецепторах
^ г-, о
со со г-"
СО CN <N
ffi Ооо ft о о. со
Рецептор глюкокортикоида
I I I I МГ II
-ДНК-
-Дексаметазон -
N-конец
С-конец1
Результаты определения активности CAT
3*ацетилхлорамфеникол -> ФФ ФФ ФФ фф
Ф
1-ацетилхлорамфеникол -> ft Щ ф ф Ф Ш ф
ф
Хлорамфеникол-*" фф ФФ ФФ % ф ф ф фф фф ф ф фф
ФФ фф
Дексаметазон i_+i_ + i_+l_+r " + i - + i + i +
331 287 270 239 200 190 180 123 101
27 О
Отсутствующие С-концевые аминокислоты
170 Глава 10
клеток, котрансфицированных кодирующей последовательностью :
интактного рецептора, была такой, как и ожидалось: в отсутствие ¦
глюкокортикоида активность CAT не обнаруживалась, а в присутствии
глюкокортикоида (дексаметазона) активность CAT л(r) ко выявлялась. Шесть
мутантных рецепторов, у которых отсутствовали 27, 101, 123, 180, 287 и
331 аминокислотный остаток а карбоксильном конце, .были неспособны
стимулировать экспрессию CAT в присутствии или в отсутствие
дексаметазона. Напротив, четыре мутантных рецептора, у которых
отсутствовали 190, 220, 239 и 270 аминокислотных остатков на
карбоксильном конце, активировали экспрессию CAT как в присутствии, та! и
в отсутствие дексаметазона. В специальных эксперимента! было показано,
что мутантные и интактные рецепторы синтезе ровались в равных
количествах.
Как данные этих экспериментов могут помочь выбрать одщ из
предложенных моделей гормон-зависимого превращения нор мального рецептора
в форму, связывающуюся с ДНК? Чк . происходит при связывании гормона:
образуется сайт связыванк с ДНК или же открывается существовавший ранее
сайт связи : вания с ДНК?
Молекулярно-генетические механизмы образования различных типов клеток
(МБК 10.3)
10-14 Заполните пропуски в следующих утверждениях.
A. Сайт-специфическая инверсия сегмента ДНК у Salmonella, сопро
вождающаяся сменой типа синтезируемого флагеллина, извесга под
названием____________
Б. У дрожжей диплоидные клетки образуются в ходе процесс)
__________, при котором происходит слияние двух г аплоидны
клеток.
B. Образование трех типов клеток у дрожжей-а, а и диплоидны
a/а-контролируется главными белками-регуляторами, закодиро ванными
в локусе_____________
Г. Механизм переключения, от которого зависит, будет ли баки риофаг
лямбда размножаться в цитоплазме Е. coli (привол к гибели клетки-хозяина)
или же он встроится в ДНК клети хозяина, контролируется двумя белками-
регуляторами гено фага лямбда-______________ и____________.
