Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
гена 5S-PHK на транскрипцию? Объясните ваш ответ.
Б. Совпали ли результаты транскрипции с матриц, обработанных разными
рестриктазами, с ожидаемыми? Объясните ваш ответ.
B. В вашем опыте реплицировалась
примерно половина молекул ДНК. Указывает ли характер транскрипции после
репликацш и расщепления рестриктазами на то, что транскрипционный
комплекс остается связанным с геном 5S-PHK в ходе репликации!
Г. В данных опытах было четко
показано, что более 90% молекул образовывали активные транскрипционные
комплексы и 50% молекул реплицировались. Как изменились бы ваши данные,
ес.т бы только 50% молекул образовывали активные транскрипционные
комплексы? Изменились ли бы ваши выводы?
10-20 Вы изучаете значение метилирования
ДНК для регуляции экспрессии генов, используя в качестве тест-системы ген
у-глобииа человека. Глобиновую мРНК можно обнаружить, когда этот ген
встроен в геном фибробластов мыши, хотя и в гораздо меньшш количествах,
чем в эритроцитах. Если, однако, ген предварительно метилировать по всем
27 сайтам CG, его экспрессии полностью блокируется. Вы используете эту
систему для ответа на вопрос о том, достаточно ли одного ключевого сайта
метилирования для регуляции экспрессии глобина.
Для получения нескольких
отличающихся друг от друга конструкций гена у-глобина, не метилированных
в различны! участках, вы используете комбинацию методов сайт-специфи-
Рис. 10-12
на транск (задача К зуклцийс" и содерж; Указаны < вительньи риктазам]
наиболее выявляем Б. Метил гена у-гл( части ген том. Вни: но шесть
мотора. ? у-глобина приведен процент с не содеря сайтов.
12-1428
Контроль генной экспрессии
177
Рк. 10-12. Влияние метилирования на транскрипцию гена у-глобина (задача
10-20). А. Фрагмент, образующийся при обработке Hindlll в содержащий ген
у-глобина.
Ушаны сайты расщепления чувствительными к метилированию рест-риктазами
Cfol и Hpall и размеры наиболее крупных фрагментов, шямяемых в геле, (см.
рис. 10-13). Б. Метилированные конструкции гена у-глобина. Метилированные
части гена отмечены черным цветом. Внизу показано более подроб-"о шесть
сайтов CG вокруг промотора. Уровень экспрессии РНК у-глобина для каждой
конструкции приведен справа и выражен как процент от экспрессии
конструкции, не содержащей метилированных сайтов.
А. Карта рестрикции
Hind Cfo Cfo
L_J____________I
Hpa ___I__¦
Cfo Cfo
_J_____________I
Hpa Hind ____I___I
-1,3-
Экзоны 1 и 2 Экзон 3
-----------------------1,8-------------------<
-2,0-
-2,6-
- 1,3-
Транскрипция
J___I
HI О Hi О Hi 100 ¦1 О
HI о
H110
ческого мутагенеза и затравочного синтеза в присутствии 5-ме-тил-dCTP.
Эти конструкции приведены на рис. 10-12; метилированные области отмечены
черным. В нижней части рисунка показано расположение вокруг промотора
шести сайтов метилирования. В конструкции Е не метилированы сайты 11, 12
и 13, в конструкции D не метилированы сайты 14, 15 и 16, в конструкции F
все шесть сайтов остаются неметилированными. Вы вводите эти конструкции в
фибробласты мыши, выращиваете линии клеток с отдельными конструкциями и
измеряете уровень синтеза в них РНК у-глобина, который сравниваете с
уровнем синтеза в линиях клеток, содержащих полностью неметилиро-ванную
конструкцию (рис. 10-12, Б).
Для проверки того, что характер метилирования наследуется точно, вы
получаете препараты ДНК из линий клеток, содержащих конструкции В, С и F,
и обрабатываете их HmdHI в сочетании с Cfol или с Hpall. Cfol и Hpall не
расщепляют узнаваемые ими участки, если последние метилированы. Сайты
расщепления для этих ферментов показаны на рис. 10-12, А, где указаны
также размеры образующихся рестрикционных фрагментов, превышающие 1
т.п.н. Вы разделяете рестрицированные препараты ДНК в геле и
визуализируете их путем гибридизации с мечеными HindIII-фрагментами (рис.
10-13).
А. Для получения некоторых метилированных ДНК вы используете в качестве
матрицы одноцепочечный вариант гена и проводите затравочный синтез на
второй цепи, вводя в реакцию вместо dCTP 5-метил^СТР. Этот метод
позволяет получить молекулу
Б. Конструкции
Последовательности CG вокруг промотора
178 Г лава 10
Рис. 10-13. Рестрикционный анализ ДНК из линий клеток, содержащих
