Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
j:
390
J J JJ J
-127 -81 -61 -50 -11
ДНК слева от этих точек делетирована
В. ТРАНСКРИПЦИЯ IN VITRO Ядерный экстракт
Дикий
тип
Делеция
Конец -11 -50 -61 -81 -127
делегированного фрагмента
Система с
очищенными компонентами
-11 -50 -61 -81 -127
ции в очищенной системе и в грубых экстрактах. В качеств!
внутренного контроля вы смешиваете препарат каждой из делегированных
молекул с препаратом целой матрицы, транскрипт с которой имеет несколько
большую длину (рис. 10-6, А). Результаты этих определений приведены на
рис. 10-6, В. Делеции вплоть до положения -61 не влияют на транскрипцию,
а делецш в положении - 11 инактивирует транскрипцию как в очищенных
системах, так и в экстрактах. Удивительно, что ДНК с делецией в положении
-50 транскрибируется так же эффективно, ка и неделетированная матрица в
очищенной системе, но не в экстрактах.
Вы выделяете белок, ответственный за этот эффект, и
показываете, что он стимулирует примерно в 10 раз транскрипции с
неделетированной матрицы и с ДНК, несущей делецию в положении - 61, но не
стимулирует транскрипцию с матрицы, содержащей делецию в положении -50.
Результаты футпринтинга показали, что этот фактор связывается с
определенной короткой последовательностью, расположенной перед ТАТА-
боксом. Более того, если в отсутствие TFIID этот фактор связывается со
своим сайтом на очень короткое время (время полужизни 20 с), то в
присутствии TFIID он связывается стабильно (время полужизни превышает 5
ч).
A. Где находится сайт связывания стимулирующего фактора?
Б. Почему добавление стимулирующего фактора в присутствш
других очищенных компонентов транскрипции вызывает исчезновение
транскриптов с матрицы, имеющей делецию в положенш -50?
B. Как вы полагаете, почему существует такая заметная разница в
стабильности связывания этого стимулирующего фактора присутствии и в
отсутствие TFIID?
10-12 Вы провели клонирование нескольких неполных последователь ностей
кДНК, кодирующей фактор транскрипции, в экспрессной-ном векторе, чтобы
определить, будут ли соответствующие этим
А. КАРТ>
1
2
3
4-------
Б. ОПРЕ; ЗАМЕ
1 -
*
5 2 -?
|3 -*
4
1
Рис. 10-7
последоЕ рующих и опреде белков м (Б). Радр ловлена 10-12).
Рис. 10-8,
делеций 1 тикоиднс 10-13). С рисунка ] в рецепте ДНК и у' Кортикои С-
концев] В нижней ставлены определе! добавлен] там С14-> пятно - эт
вступивш Пятна -пр одной ил] к хлорам! (+) или с зона указ щими ДО[
Контроль генной экспрессии 169
И. КАРТА КЛОНОВ
1
2 ------
3 -------------
4----------------
S, ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАМЕДЛЕНИЯ В ГЕЛЕ
1
?
1 2
2
I3
?
4
- - + - + + +
Рк. 10-7. Структура неполных последовательностей кДНК, кодирующих фактор
транскрипции, (А) в определение кодируемых ими белков методом торможения
в геле (?). Радиоактивность полос обусловлена меченой ДНК (задача 10-12).
Рк. 10-8. Влияние С-концевых делеций на активность глюкокор-тикоидного
рецептора (задача
10-13). Схема в верхней части рисунка показывает расположение в
рецепторе участков связывания ДНК и участков связывания глюко-юртикоида,
а также локализацию С-концевых делеций. На схеме
I нижней части рисунка представлены результаты стандартного определения
активности CAT путем добавления к клеточным экстрактам С14-
хлорамфеникола. Нижнее шггно-это хлорамфеникол, не вступивший в реакцию,
верхние пятна-продукты присоединения одной или двух ацетильных групп t
иорамфениколу. Присутствие (+) или отсутствие (-) дексамета-зона указано
под соответствующими дорожками.
фрагментам части белка связываться с энхансером, узнаваемым целым
фактором транскрипции. Клоны, содержащие неполные последовательности
кДНК, укорочены на разные отрезки со стороны 5'-конца гена (рис. 10-7,
А). Вы транскрибируете, а затем транслируете эти клоны кДНК in vitro и
