Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
спаривания геиы
Гаплоидные Дикий тип М М Msg
клетки MI Нет спаривания Msg, Fsg
NI М Msg
MI', М2~ Нет спаривания Msg, Fsg
Дикий тип F F Fsg
F1 - F Fsg
F2" Нет спаривания Fsg, Msg
F1", F2" Нет спаривания Fsg, Msg
Диплоидные Дикий тип М, F Нет спаривания Ssg
клетки МГ/Fl" F Fsg
M1-/F2- Нет спаривания Msg, Fsg, Ssg
M2-/F1- Нет спаривания Нет
M2-/F2- М Msg
Msg - М-специфические гены; Fsg-F-специфические гены; Ssg-гены,
специфические для споруляции.
ский тип экспрессии генов. Вы как раз располагаете системой, с
помощью которой можно было бы проверить это предположение. Вы можете
собрать активный транскрипционный комплекс на гене 5S-PHK из Xenopus,
встроенном в плазмиду, индуцировать его репликацию и затем проверить
транскрипцию реплицировавшихся генов. Все эти стадии вы можете проводить
in vitro.
Чтобы различить реплицировавшуюся и нереплицировав-шуюся
матрицы, вы используете преимущества рестриктаз (Dpnl, Mbol и Sau3A),
чувствительных к метилированию своего сайта узнавания GATC (рис. 10-11,
А). Эта последовательность в нача-
Ген 5S РНК Dpnl Mbol Sau3A
м
+ - +
м
Нормальный ген ----------1 | - + +
(неметилированный)
Максиген
(метилированный)
Нормальный ген
(наполовину
метилированный)
М
м +
м
м
м +
м +
Репликация
Без обработки Dpnl Mbol Sau3A
Без Без
обра- обра-
ботки Dpnl Mbol Sau3A ботки Dpnl
Mbol Sau3A
Максиген-
Ген 5S -> РНК
I
176 Глава 10
|
f
ле гена 5S-PHK встречается лишь
один раз, и если разрезать! ДНК по этому сайту, то транскрипция не
происходит. Если-выращивать матрицу в культуре Е. coli дикого типа, то
последо-1 вательность GATC будет метилирована по А в обеих цепям
бактериальной i/am-метил аз ой. При репликации полностью метилированной
ДНК in vitro в первом цикле образуются дочерние дуплексы, у которых
метилирована только одна цепь (наполовину метилированные), а при
последующих репликациях-немети-лированные ДНК. Ваша идея заключается в
том, чтобы, начав с полностью метилированной ДНК, индуцировать ее
репликацию in vitro. Затем вы можете определить транскрипцию в
реплицировавшейся ДНК, обработав ее Dpnl, которая разрежет нереп-
лицировавшуюся ДНК (полностью метилированную) и таким образом остановит
транскрипцию, но не расщепит реплицировавшуюся ДНК (метилированную
наполовину или совсем неме-тилированную).
Для проверки того, будет ли
работать аналитическая часть вашей схемы, вы конструируете ген несколько
большего размера, чем нормальный ген 5S-PHK (макси-ген), чьи транскрипты
можно отличить от транскриптов нормального гена 5S-PHK (рис. 10-11, А).
Затем вы готовите смесь полностью метилированного максигена с наполовину
метилированным или немети-лированным нормальным геном и определяете их
транскрипц/(tm) до и после обработки Dpnl, Mbol и Sau3A. Специфичность
рестриктаз приведена на рис. 10-11, А, а результаты эксперимен тов по
транскрипции-на рис. 10-11,27.
Для определения воздействия
репликации на транскрипцию вы собираете транскрипционные комплексы на
полностью метилированном макси-гене, индуцируете репликацию и изучаете
транскрипционную активность до и после обработки рестрикта-зами.
Результаты приведены на рис. 10-11,27.
A. Влияет ли уровень метилирования
