Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
интактными регуляторными последовательностями, расположенными перед
промотором. Б. Ген, в котором сайты связывания ntrC делетирова-ш. В. Ген,
в котором сайты связывания с белком ntrC передвинуты к З'-концу.
Б. Объясните, почему /яс-оперон не индуцируется лактозой во время
короткой начальной фазы роста бактерий.
10-9 Транскрипция бактериального гена, кодирующего фермент глута-
минсинтетазу, регулируется в соответствии с доступностью клеточного
азота. Ключевым регулятором транскрипции в этом случае является белок
ntrC, который стимулирует транскрипцию только после того, как будет
фосфорилирован. Фосфорилирование белка ntrC контролируется белком ntrB,
который одновременно является протеинкиназой и протеинфосфатазой.
Равновесие между киназной и фосфатазной активностями, а следовательно,
фосфорилирование белка ntrC и транскрипция глутаминсинтетазы определяется
другими белками, которые зависят от соотношения а-кето-глутарата и
глутамина. (Это соотношение является чувствительным индикатором
доступности азота, поскольку для образования глутамина к а-кетоглутарату
должны присоединиться два атома азота в виде аммония.)
Транскрипцию гена глутаминсинтетазы можно получить in vitro,
если к линейной ДНК-матрице, содержащей ген и соответствующие
регуляторные элементы, расположенные перед промотором, добавить РНК-
полимеразу, специальный сигма-фактор и фос-форилированный белок ntrC.
Анализ ДНК методом футпринтинга показывает, что белок ntrC связывается с
пятью сайтами, расположенными перед промотором. Хотя связывание белка
ntrC лишь незначительно увеличивается при фосфорилировании, транскрипция
тем не менее полностью зависит от фосфорилирования. Однако даже в
отсутствие белка ntrC РНК-полимераза прочно связывается с промотором.
Участие белка ntrC в активации транскрипции исследовали далее с
использованием трех различных матриц: обычного гена с интактными
регуляторными последовательностями, гена с делегированным сайтом
связывания ntrC и гена, в котором три из пяти участков связывания белка
ntrC перемещены к З'-концу (рис. 10-4,
^ Сайты связывания Ген
ntrC глутаминсинтетазы
t
Сайт связывания РНК-полимеразы
/¦% я Г ен
Сайты связывания глутаминсинтетазы
ntrC
делегированы
Г
-Ш?
Сайт связывания РНК-полимеразы
Сайты связывания ntrC Г ен
перемещены
глутаминсинтетазы на другую сторону I -¦ ¦ > от
гена
Сайт связывания РНК-полимеразы
166 Глава 10
Рис. 10-5. Расположение сайтов связывания с белком агаС в опероне araBAD
(А) и эффект изменения расстояния между сайтами связывания с агаС (Б)
(задача 10-10). Б. Гены araBAD замещены геном galK, и в сайте встраивания
добавлено или делетировано различное число нуклеотидов, как указано на
шкале внизу. Колонии клеток, не экспрессирующих галак-токиназу,-белые;
колонии клеток, образующих галактокиназу,- красные.
Б. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГАЛАКТОКИНАЗЫ
А. РЕГУЛЯТОРНАЯ ОБЛАСТЬ araBAD
2
Сайты, где
белок ага С связывается с ДНК и осуществляет регуляцию генов araBAD
Сайт
встраивания
i
t
РНК-полимераза связывается здесь
100 нуклеотидов
araBAD
г
Красная Белая
16 -11 -8
0 5 11 15 20 24
Размер вставки
31
А, Б я В соответственно). В отсутствие фосфорилированного бело; ntrC
транскрипции на всех этих трех матрицах не наблюдалось; В присутствии 100
нМ фосфорилированного белка ntrC транскрт ция во всех трех случаях
достигала максимального уровня. Однаи : концентрации белка ntrC,
необходимые для достижения урови синтеза, равного половине максимального,
для этих трех гена значительно различались: для нормального гена (А)
требовалась концентрация 5 нМ, для гена с сайтом связывания на З'-конщ
(Л) -10 нМ, а для гена с делегированным сайтом связывания Ьелю ntrC (Б)-
50 нМ.
A. Если РНК-полимераза может связываться с промотором геш
глутаминсинтетазы в отсутствие белка ntrC, то почему для актша ции
транскрипции нужен этот белок? •
Б. Если белок ntrC может связываться с соответствующими сайтам
независимо от того, фосфорилирован он или нет, то почему да .
транскрипции необходимо фосфорилирование?
B. Если белок ntrC может активировать транскрипцию даже в отсут ствие
сайтов его связывания, то зачем нужны эти сайты?
10-10 Механизм регуляции арабинозного оперона у Е. coli весьм сложен.
