Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
наиболее часто используются для иммобилизации ферментов; для этих целей
также весьма полезными, по-видимому, могут оказаться некоторые
керамические носители. Очень много данных, подкрепленных многочисленными
примерами иммобилизованных ферментов, их свойств и применения, имеется в
ряде обзоров и монографий [2, 15, 37, 39, 44, 57, 58].
Влияние, которое оказывают связывание и носитель, 'можно легко оценить
для иммобилизованных ферментов на основе определения их ферментативных
активностей. Наиболее часто указывается относительная активность, т. е.
отношение активности 1 г сухого иммобилизованного фермента к произведению
количества связанного фермента (в миллиграммах на 1 г сухого препарата)
на его активность в растворе. Примеры относительной активности ферментов,
связанных с носителями с помощью различных методов, а также эффективности
связывания приведены в табл. 12.1 [45].
Различие в кинетических свойствах свободного и ковалентно связанного
фермента обусловлено рядом факторов.
а) Влияние диффузионных ограничений. По аналогии с неферментативным
гетерогенным катализом, где скорость диффузии реагентов в направлении
активной поверхности катализатора играет важную роль в определении
кинетики реакции, в катализе иммобилизованными ферментами скорость
диффузии субстрата в связывающий центр фермента также в значительной
степени влияет на кажущиеся кинетические параметры системы связанного
фермента.
Иммобилизованные ферменты
423
Таблица 12Л
Эффективность связывания
Производное Метод связывания Свяадаь пне, % Отеосвтелымя активность3, %
Сефароза-а-химотрипсин BrCN 50 25-40
кю< 100 6
Целлюлоза- (СНг)*-NH-о-химо- Глутаральдегнд 70 6
трипсин
Полиакриламид-NH(CH2)e-NH- ЭДК6 10 5
-а-химотрипсин
BrCN 40 30
Полиакриламид-NH-(СНг)г- BrCN 25 8
-NH-"-химотрипсин 25
Полиакриламид-NH-NH-а-химо- BrCN 8
трипаин 30
Полиакриламид-'С1-химотрипСин NaNOa 40
Стекло-NH-а-химотрипсин BrCN 65 35
Глутаральдегнд 100 10
Стекло-NH-трипсин BrCN 100 22
Стекло-NH-субтилизин BrCN 60 100
Глутаральдегнд 75 100
Сефароза-субтилизин BrCN 90 40
Относительно активности свободного фермента. Активность химотрипсина н
субтилиэн-на была измерена на pH-стате; в качестве субстрата
использовался этиловый эфир ацетил-
тирозина (pH 3), а для трипсина - этиловый эфир бензоиларгнннна (pH 8),
(r) ЭДК- 1-Этил'3*(3-днметиламниопропил)карбодиимид.
Поверхность нерастворимого носителя с ковалентно связанным ферментом в
водной суспензии окружена неперемешиваемым слоем растворителя [15]. При
ферментативной реакция в непереме-шиваемом слое перпендикулярно к нему
устанавливается градиент концентрации субстрата. Насыщение
иммобилизованного фермента происходит при концентрации субстрата, более
высокой, чем это требуется для насыщения соответствующего нативного
фермента в растворе. Это приводит к возрастанию кажущейся константы Ми-
хаэлиса /Ст(к аж)-
б) Пространственные эффекты. Ковалентное присоединение фермента к
поверхности нерастворимого носителя может привести к стерическим
ограничениям его доступности для высокомолекулярных субстратов. Так,
например, ковалентно присоединенные протеолитические ферменты в
большинстве случаев обладают более высокой эстеразной относительной
активностью, чем протеаз-ной [19]. Пространственные ограничения приводят
также к недоступности некоторых связей в белках для протеолитического
расщепления иммобилизованными протеиназами, тем самым изменяя их
специфичность в отношении высокомолекулярных субстратов. Так, например,
Онг и др. [42] расщепляли пепсиноген как свобод-
28*
424
Глава 12
ным.так и иммобилизованным трипсином (связанным с сополимером этилена и
малеинового ангидрида). Оба гидролизата отличались друг от друга по их
картине хроматографического разделения на сефадексе G-25 и пептидными
картами индивидуальных пиков. Кроме пространственных эффектов
определенную роль играет также полиэлектролитная природа
иммобилизованного ферментного производного, поскольку между заряженным
носителем и белковым субстратом могут осуществляться электростатические
взаимодействия.
в) Влияние химической модификации ферментов. Ковалентное присоединение
ферментов к полимерному носителю влияет на кинетическое поведение
связанного фермента в результате изменения его суммарного заряда, влияния
его ближайших соседей на область активного центра и изменения
внутримолекулярных взаимодействий [15]. Такие же эффекты наблюдаются при
химической модификации фермента низкомолекулярными реагентами. Так,
например, ацетилирование и сукцинилирование химотрипсина приводят к
смещению оптимума зависимости активности от pH в направлении более
щелочных величин pH по сравнению с нативным хи-мотрипсином. Однако это
смещение наблюдается только при низкой ионной силе раствора и может быть
устранено повышением ионной силы. Это явление, возможно, объясняется
возрастанием суммарного отрицательного заряда белка в результате
блокирования аминогрупп и соответствующим увеличением рК" имидазоль-ной
