Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Кт(кзж) и константа скорости деацилирования Азцсаж) существенно зависят
от концентрации органического растворителя.
Поведение растворимой и иммобилизованной кислой фосфата-зы в
водноорганических растворах изучено Уоном и Хорватом [54]. Несколько
причин привело к этому исследованию. Во-первых, оно позволяет проводить
дальнейшие эксперименты, ведущие к лучшему пониманию механизма
.ферментативной активности. Во-вторых, оно открывает возможности следить
за влиянием температур <0°С, что невозможно осуществить в водных
растворах. Поскольку, in vivo ферменты, связанные с мембраной, обычно
находятся в липофильном микроокружении, исследование действия ферментов в
водноорганических растворителях или на матрицах с гидрофобными группами
может внести вклад в выяснение поведения ферментов в их естественном
окружении. Ферментативные реакции в органических растворителях могут быть
также использованы для субстратов с низкой растворимостью в воде. Так,
Уон и Хорват [54] исследовали расщепление л-нитрофенилфосфата кислой
фосфатазой в различных водноорганических смесях и обнаружили, как
правило, более высокую активность иммобилизованных ферментов по сравнению
со свободным ферментом. Для смесей [1:1) различных растворителей с
цитратными буферами с различными pH установлено, что ферментативная
активность зависит от pH водного буферного компонента,' а не от pH
водноорганической смеси, измеренного стеклянно-каломельной электродной
парой. Из этого следует, что иммобилизованные ферменты менее
экспонированы в органические растворители, потому что истинная
концентрация воды выше в непосредственной близости к иммобилизованным
молекулам белка, чем во внешнем растворе. Кроме
438
Глава 12
того, ковалентные внутри- и, возможно, межмолекулярные связи могут
стабилизировать структуру фермента.
Глутаматдегидрогенеза является субъединичным гексамерным ферментом с
молекулярной массой 336 ООО. В присутствии ADP она образует линейные
агрегаты с молекулярной массой 2-106, обладающие очень высокой
активностью. Для того чтобы решить вопрос, является ли наблюдаемое
возрастание активности следствием образования агрегатов или ADP действует
как аллостериче-ский модулятор или эффектор непосредственно на
"мономерную" форму, а агрегация - это только вторичное явление, Хортон и
др. [25] присоединили "мономерную" форму глутаматдегидрогеназы к пористым
стеклянным микросферам. Установлено, что в присутствии ADP даже в этом
случае происходит возрастание активности, то есть возрастание активности
не зависит от ассоциации.
Иммобилизация протеолитических ферментов предотвращает их автолиз (и
также агрегацию) и позволяет проводить исследования даже в условиях,
когда в случае свободных ферментов происходит быстрый автолиз. Примером
является исследование термически индуцируемых конформационных переходов
иммобилизованных а- и {5-трипсинов при 20-75 °С [12].
Иммобилизация может быть использована также для предотвращения спонтанной
ассоциации между субъединицами олигомерных белков. Она позволяет,
например, определить, является ли субъединичная форма фермента
каталитически активной. Если да, то сравнение свойств фермента со
свойствами соответствующего иммобилизованного олигомера может дать ценную
информацию о влиянии взаимодействий субъединиц на ферментативные функции.
Примером может служить работа Чена и др. [6], иммобилизовавших мышечную
альдолазу в условиях, когда присоединяется только одна из четырех
субъединиц. С помощью гуанидинхло-рида молекулы фермента, связанного с
нерастворимым носителем, были диссоциированы и элюированы с колонки таким
образом, что на колонке остались только ковалентно связанные развернутые
субъединицы. Удаление диссоциирующего реагента приводило к свертыванию в
нативную конформацию иммобилизованных субъединиц. При использовании
мягких диссоциирующих реагентов было показано, что иммобилизованный
мономер обладает той же активностью, что и тетрамер.
Иммобилизация позволила также механическим путем регулировать
каталитическую активность иммобилизованных ферментов [3].
Иммобилизованный трипсин на эластичном носителе, как, например, на
найлоне, уменьшает ферментативную активность при растягивании носителя -
найлонового волокна. Причина этого может состоять в деформации молекул
белка. Из-за небольшого объема молекул фермента такие механохимические
исследования трудно осуществить другим путем без иммобилизации.
Иммобилизованные ферменты
439
12.4.3. Модели биологических систем
В настоящее время общепринято, что только немногие ферменты in vivo
действительно существуют в виде свободного белка в водной среде и что
большинство из них связано с мембранами или нерастворимыми ансамблями или
находятся в гелеобразном окружении. По Кемпиеру и Миллеру [28], например,
фактически все внутриклеточные ферменты водоросли Euglena gracilis
связаны с корпускулярными фракциями клетки.
Ферменты, присоединенные к хорошо охарактеризованным носителям, могут
