Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
1322. Zdller M" Matsku S., Rapp W., Biochim. Biophys. Acta, 427, 708-718
(1976).
1323. Zotton R. P., Mertz E. Т., Can. J. Biochem,, 50, 529^-537
(1972).
1324. Zotton R. P., Mertz E. Т., Russell H. Т., Clin. Chem., 18, 654-
657 (1972).
27*
Глава 12
Иммобилизованные ферменты
Методы, основанные на применении иммобилизованных биологических молекул,
оказались полезными во многих областях [38]. Многочисленные примеры
демонстрируют, каким образом биологически активные вещества, связанные с
нерастворимыми матрицами, испрльзуются в аффинной хроматографии.
Исследование ферментов, связанных с нерастворимыми матрицами, так же как
и их применение, тесно связано с аффинной хроматографией. Развитие
технологии иммобилизации ферментов происходило одновременно с работами в
области аффинной хроматографии. Изучение иммобилизованных ферментов -
один из наиболее развивающихся разделов современной энзямологии. Кроме
того, иммобилизованные ферменты являются также наиболее изученными
аффинными лигандами, и поэтому им посвящена отдельная глава.
12.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
На симпозиуме по ферментной инженерии (1971 г., США) рекомендовано
присвоить индивидуальные названия различным системам модифицированных
ферментов [47], например термин "иммобилизованный" вместо
"инсолюбилизованный", "матрицированный" и т. п.
Можно выделить четыре основных класса иммобилизованных ферментов:
1) ферменты, иммобилизованные путем физической или химической сорбции;
2) ферменты, ковалентно присоединенные к растворимым или нерастворимым
полимерам;
3) сшитые молекулы ферментов, например, подходящими бифункциональными
реагентами;
4) ферменты, включенные в гели, мембраны или микрокапсулы.
Иммобилизованные ферменты
421
Для классификации ферментов полезна следующая схема:
Ферменты
Модифицированные Машинные
1 Иммобилизованные^
Включенные Связанные
| | f 1
Включенные Ми.крокапсу¦ Адсорбированные Ковалентно
в матрицу лированные (АДС) связанные
(ВКЛ) (МИК) (КСВ)
Большая часть иммобилизованных ферментных систем, хотя и необязательно
все из них, соответствует этой схеме. Рекомендовано вводить символы ВКЛ,
МИК, АДС и КСВ между названием носителя и фермента, характеризуя тем
самьгм любой из четырех классов иммобилизованных ферментов. Так,
например, трипсин, ковалентно связанный с карбоксиметилцеллюлозой,
следует обозначать как КМ-целлюлоза-КСВ-трипсин, уреазу, включенную в
капсулу из найлона,- как найлон-МИК-уреаза, а глюкоамилазу, включенную в
полиакриламидный гель,-как акриламидный гель-ВКЛ-глюкоамилаза.
Кинетические параметры этих ферментов, а именно их активность,
рекомендовано выражать для 1 г сухого препарата иммобилизованного
фермента в виде начальной скорости реакции {в мкмоль/мин), измеренной в
четко определенных условиях. Активность ферментов, связанных с
поверхностью (например, трубок, листов и мембран), предложено относить к
единице поверхности, покрытой ферментом, и выражать в виде начальной
скорости реакции (в мкмоль/мин), причем скорость должна быть измерена в
четко определенных условиях.
Рекомендовано также указывать:
а) условия высушивания препаратов иммобилизованных ферментов;
б) содержание белка в сухих препаратах;
в) удельную активность фермента перед иммобилизацией,
Измерение кинетических констант иммобилизованных ферментов не дает
истинных констант, эквивалентных полученным в гомогенных растворах,
потому что на измеряемые параметры оказывают существенное влияние
физические факторы, такие как диффузия. По этой причине максимальная
скорость реакции и константа Михаэлиса должны расматриваться как
"кажущиеся" величины V-VaaiK И К.т = ^Ст(каж). Кт(каж) определяется,
следовательно, как концентрация субстрата, при которой скорость реакции
соответствует половине УКаж. Другие кинетические константы должны быть
представлены также как соответствующие кажущиеся величины.
28-6
422
Глава 12
При обсуждении параметров, характеризующих устойчивость иммобилизованных
ферментов, существенно указать все специфические условия их измерения. В
заключение рекомендовано при сообщениях о новой системе для ковалентного
присоединения ферментов давать следующую информацию:
а) число реакционноспособных групп на единицу массы;
б) максимальное число связанных небольших молекул, так же как и
высокомолекулярных веществ (белков), на определенную массу носителя
(полимера).
12.2. ПРИСОЕДИНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ К НЕРАСТВОРИМЫМ НОСИТЕЛЯМ И АКТИВНОСТЬ
ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
В настоящее время наиболее распространенными методами иммобилизации
ферментов являются методы ковалентного присоединения к нерастворимым
носителям. Требования, предъявляемые к свойствам нерастворимых носителей,
перечень этих носителей и ряд методов для присоединения белков детально
обсуждаются в гл. 8. Некоторце методы, пригодные для характеристики
иммобилизованных ферментов, содержатся в гл. 9. Несмотря на то что
стеклянные носители редко применяются в аффинной хроматографии, они
