Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
группы гистидина в активном центре химотрипсина. Влияние химической -
модификации может быть легко объяснено для систем, в которых
использовался носитель, не несущий зарядов. В случае полиэлектролитного
носителя эффекты химической модификации возникают в результате
значительно более сильных электростатических эффектов заряженного
носителя.
г) Влияние микроокружения. Влияние .микроокружения на кинетическое
поведение иммобилизованных ферментов было изучено главным образом для
ферментов, присоединенных к полиэлектро-литным носителям, создающим
своими зарядами электростатическое поле.
Наиболее полно исследовано влияние полианионных и полика-тионных
носителей на кинетические свойства протеолитических ферментов. Кроме
упомянутого влияния электростатического поля лолиэлектролитных носителей
возникают и другие эффекты микроокружения, такие как влияние носителя на
диэлектрическую .проницаемость фазы иммобилизованного фермента или
влияния на локальную растворимость субстратов или продуктов. Эффекты
микроокружения связаны, кроме того, с ферментативной активностью, а
именно в ходе катализа меняются локальные концентрации субстрата,
продукта, протонов, эффекторов и т. д. Ряд примеров такого рода
исследований приведен ниже.
Иммобилизованные ферменты
425
Каким образом могут влиять на активность ферментов некоторые свойства
носителей или тип присоединения фермента и насколько сильно это влияние,
показано ниже на нескольких примерах. Один из наиболее важных факторов -
состав реакционноспособных групп. Датта и Оллис [10] исследовали
зависимость удельной активности иммобилизованного а-химотрипсина от
концентрации гидразидных групп на поверхности гранул биогеля Р-2 (рис.
12.1). Обнаружено, что кривая зависимости имеет острый максимум. На
химотрипси-не, лизоциме и липазе изучались изменения удельной активности
не только после их иммобилизации, но одновременно и после обработки
растворимыми аналогами носителей с теми же химическими группами, которые
использовались для связывания белка с поверхностью носителя. Во всех
случаях наблюдалась корреляция поведения модифицированных ферментов в
растворимом состоянии и в иммобилизованном виде. Манеке и Фогт [33]
исследовали количество папаи-на, связанного с носителями на основе
поливинилового спирта, в зависимости от концентрации на носителе
реакционноспособных диазониевых групп. Как следует из табл. 12.2, с
возрастанием количества реакционноспособных групп носителя количество
связанного папаина проходит через максимум, в то время как относительная
активность постепенно понижается. Одной из причин такого уменьшения
активности может быть неблагоприятное влияние многоточечного
присоединения молекул фермента к носителю, который содержит избыток
реакционноспособных групп. Подобные результаты были получены также с
иммобилизованным пепсином [53]. Препараты, содержащие 13 мг связанного
пепсина на 1 г сухого носителя, имели относительную протеолитическую
активность 92,8%, содержащие 46,8 мг/г -65,7%, 50,8 мг/г -45,3%, а 65
мл/г - 37,8%.
Природа носителя и тип присоединения фермента влияют, однако, не только
на активность, но в значительной степени также
ммодь/г сухого препарата,
Рис. 12.1. Зависимость удельной активности иммобилизованного а-
химотрипси-на от концентрации поверхностных гид-разидных групп на
гранулах биогеля Р-2 [101.
426
Глава 12
Таблица 12.2
Зависимость количества связанного папаина от содержания
реакционноспособиых групп носители, приготовленного из поливинилового
спирта, сшитого 5%-иым терефталевым альдегидом и 2-(л-аминофенил)-1,3-
диоксолаиом
Число групп, ммоль/л Количество связанного папаина*, мг/г
Относительная активность иммобилизованного папанна(r), %
1.8 615 7,7
1,6 635 9,5
1,4 685 12,0
1,1 335 14,8
0,6 310 20,8
0,3 300 21,5
* Условия сочетания: 1 М NaHCOj, 4 °С, 15 ч.
(r) Субстрат: этиловый эфир бензоил-Ь-аргннина, 0,05 М, pH 6,0, 30 °С.
на такие свойства, как, например, зависимость активности от температуры и
pH. Влияние носителя на оптимальную температуру катализируемого трипсином
гидролиза казеина хорошо видно на рис. 12.2 [5]. Если для свободного
трипсина оптимальная температура <40 С, то для трипсина, связанного с
сополимером этилена и малеинового ангидрида, она несколько <60 °С, а для
трипсина, связанного с КМ-целлюлозой, >70 °С.
Влияние ионизирующих групп носителя на зависимость активности от pH для
свободного химотрипсина, его полиаиионного производного (химотрипсина,
связаного с сополимером этилена и малеинового ангидрида) и его
поликатионного производного (химотрипсина, связанного с полиорнитином)
представлено на рис. 12.3 ?17]. Активность фермента определялась по
гидролизу этилового эфира Ы-адетил-Ь-тирозина при низкой ионной силе
.раствора. В этом случае очень важна информация об ионной силе, поскольку
изменение активности с изменением pH у химотрипсина, трипсина и его
производных зависит от ионной силы [18]. Сдвиг оптимума pH эстеразной
