Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
фосфате (4) [30].
лизина к ДЭАЭ-декстрану активность снижалась до <200, а после
присоединения к ДЭАЭ-сефадексу - даже до 20.
Для того чтобы исследовать влияния заряженной среды на свойства
иммобилизованных протеиназ, Гольдштейн [16] приго-
Таблица 12.3
Кинетические параметры гидролиза этилового эфира Ы-ацетил-Ь-тирозина
ДЭАЭ-декстран - субтилизином, ДЭАЭ-сефадекс - субтилизииом и субтилизином
при различной ионной силе раствораа
Фермент Ионная сила Оптимум pH Кт или ^т(каж)' ммоль/л *каг
ДЭ АЭ-декстр а и-су бти- 1,0 8,4 33 470
лизин 0,125 8,0 38 320
Субтилизии 1,0 8.5 26 880
0,125 8,2 35 520
ДЭАЭ-сефадекс-субти- 1,0 9,0 110 210
ЛИЗКН 0,125 9.0 105 150
Кинетические параметры были рассчитаны с использованием линейной
регрессии из графиков Лайнунвера - Берка для данных, полученных при
соответствующих оптимумах pH и для концентраций эфира от 0,0025 до 0,025
моль/л. Ионная сила раствора доводилась добавлением КС1.
430
Глава 12
товил гидрофильные анионный.и катионный носители. Гидразин или яж-
диаминодифенилмеган (МДА) присоединялся к сополимеру этилена и
малеинового ангидрида (ЭМА):
1с*°
Hi'
"S> "
-с'° "
"S>
"Ын.
Сополимер этилена, и малеинового ангидрида, (ЭМА)
CONH-NHj
соон
-CO-NH-NHj
-СООН
эма- гидразиднал смола -СО-NH с Hj-Q- KIH*
¦соон
¦CO-NH
-соон
сн.
ЭМА-МДА-CJW/ra
Из анионных полимеров - ЭМА-гидраэидной и ЭМА-МДА-смол - получены
катионные полимеры путем присоединения к карбоксильным группам NjN-
диметил- 1,3-пропандиамина в присутствии дициклогексилкарбодиимида (КДИ):
сох
-соон
-сох
-СООН
H^fCH,-CH,-CHtN(CHi)2 а КДИ
анионная смола
-сох
-CO-NH-CHfCHfCHfNCCHjV
-сох
-CO-HH-CHfCHfCHj
катионная смола
-nh-nhj
-NH-0-CHt-^-NHi
После превращения катионных и анионных носителей в полимерные соли
диазония или ацилазиды к полимерам присоединялись трипсин, химотрипсин,
субтилизин Ново, субтилизин Карлсберга и папаии. Иммобилизация всех
ферментов повлекла за собой сдвиг оптимума pH в щелочную область, однако
эти сдвиги были на самом деле одинаковыми и для анионных и для катионных
носителей и не зависели от ионной силы среды. Для объяснения полученных
данных недостаточно электростатической модели и следует принять в
рассмотрение другие влияния, главным образом присутствие субстрата.
После очень кратковременного контакта при связывании трипсина с
оксналкилметакрилатным гелем (4 мг связанного фермента на 1 г сухого
геля) получали различное микроокружение фермента путем блокирования
остающихся реакционноспособных групп глицином, этаноламином или
этилендиамином [52]. Ни в одном случае не наблюдался сдвиг оптимума pH
для активности, определен-
Иммобилизованные ферменты
431
Таблица 12.4
Константы Мнхаэлиса нативного и иммобилизованного трипсина3
Количество связанного трипсина" мг/г *)П(кажг
86,5 0,3
273 1,4
321 1.7
400 3,1
Нативный трипсин 2,7
а Носитель: поливиниловый спирт с 5% поперечных ошибок, 1,4 ммоль/г
реакционноспособных групп. Субстрат: л-нитроаиилид бенэоиларгиника, pH
7.8.
ной по данным гидролиза я-нитроанилида бензоил-0,Ь-аргинина; ¦/(т(каж),
определенные для того же субстрата для иммобилизованного трипсина после
обработки глицином, зтаноламином или этилендиамином, составляли
соответственно 1.IM0-5; 0,9ЫО-3 и
2,5-10~3 моль/л, что сопоставимо с /Ст=0,93-10-3 моль/л для нативного
трипсина.
При определении /Ст<каж) следует принимать во внимание существенную
зависимость от количества иммобилизованного фермента, как это следует из
табл. 12.4, где приведены константы Ми-хаэлиса для нативного трипсина и
трипсина, связанного в различных количествах с поливиниловым спиртом [33,
34].
Влияние на ферментативную активность гидрофобностн носителя исследовано
Иохансоном и Мосбахом [26]. На матрицах с различной степенью
гидрофобностн (полученных с использованием сополимера акриламид-
метилметакрилат) была иммобилизована алкогольдегидрогеназа. Кт(ка"о для
н-бутанола в качестве субстрата смещались в сторону более низких значений
пропорционально возрастанию гидрофобного характера препаратов сополимера,
с которым фермент был связан.
12.3. СТАБИЛЬНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
Как и активность иммобилизованных ферментов, их стабильность также в
значительной степени зависит не только от свойств самого фермента, но и
от природы носителя и типа связи между ферментом и матрицей. Вообще
говоря, можно утверждать, что носители, содержащие гидрофобные группы,
могут денатурировать белки, аналогично тому, например, как происходит
денатурация гидрофобными растворителями. Однако близость гидрофобного
носителя не обязательно немедленно приведет фермент к денатурации;
последний может медленно инактивироваться во время хранения или обладать
повышенной чувствительностью к нагреванию,
432
Глава 12
изменению pH или денатурирующим агентам. Положительный или отрицательный
заряд на гидрофильном носителе может увеличивать или уменьшать
стабильность присоединенного фермента в результате электростатических
