Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 180

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 174 175 176 177 178 179 < 180 > 181 182 183 184 185 186 .. 198 >> Следующая

растворы; pH 3,0, 0,05 М цитрат; pH 4-5, 0,1 М ацетат; pH 6-9, 0,05 М
фосфат;
pH 10-10,7, 0,05 М карбонат.
теля. Даже понижение тсрмостабилъности катионных производных может быть
обусловлено наличием дополнительных гидрофобных остатков -(СНзЬ'боковых
цепей и концевых диметиламинных групп. Понижение термостабильности при
иммобилизации фермента можно объяснить уменьшением из-за модифицирования
фермента вероятности возвращения его в нативную конформацию после
теплового нарушения исходной структуры.
12.3.4, Устойчивость к денатурирующим агентам
Иммобилизованные ферменты часто проявляют повышенную устойчивость к
денатурирующим агентам. На рис. 12,7 показан ход необратимой денатурации
нативного и иммобилизованного хи-
Рис. 12.6. Температурная стабильность химотрипсина (а), трипсина {б) и
субтилизина Ново (в) и их анионных и катионных ЭМА-МДА- и ЭМА-гидразидных
производных [16].
/ - нативный: фермент; 2 - анионное производное ЭМА-гндразида; 3 -
катионное производное ЭМА'Гндразида; 4 - анионное производное ЭМА-МДА; 5
- катионное производное ЭМА-МДА. Испытуемые образцы (0,5 мл), содержащие
фермент или иммобилизованное производное фермента (~15 эстерэзных единиц
в 1 мл), в буфере с pH оптимальной устой' чивости (см. рис. 12,5)
инкубировали при данных температурах в течение 15 мин; отбирали аликвоты
по 0,1 мл н определяли в них стандартным методом остаточную активность
при
25 9С.
Рис. 12.7. Необратимая денатурация производных химотрипсина в 6 М
мочевине, 0,1 М фосфатном буфере (pH 8) при 25 °С [45].
/ __ нативный фермент; 2 - химотрипсин, связанный с активированной
бромцианом сефарозой; 5 -химотрипсин, связанный с активированным
бромцианом амкнопропил-стеклом; 4 - химотрипсин, связанный с
активированным бромцианом поли'($-амииооктил)акрнл-
амндом.
436
Глава 12
мотрипсина в 6 М мочевине [45]. Свободный фермент полностью
инактивируется за 90 мин, в то время как иммобилизованные производные в
зависимости от используемого носителя . сохраняют свою активность даже
после 24 ч.
12.3.5. Повышение устойчивости
Витолл и Мейсон [56] изучили устойчивость иммобилизованного папаина при
непрерывном катализе в зависимости от различных методов связывания со
стеклом. В колоночных проточных реакторах гидролизовали 1%-ный раствор
казеина при 45°С и постоянной скорости потока и нашли время половинной
потери активности (ti/3) в ходе непрерывной работы для индивидуальных
производных фермента. В то время как ti/t папаина, связанного с
алкиламиностеклом карбодиимидным методом, составляло 1,9 сут, для
производного, полученного методом азосочетания на арилами-ностекле, оно
равнялось 7,2 сут и было равно даже 35 сут для препарата с амидными
связями со стеклом, покрытым Zr02.
Устойчивость иммобилизованных ферментов можно повысить с помощью
предварительной модификации белков перед их присоединением к
нерастворимому носителю. Так, например, Кершен-гольц и др. [29]
присоединили олигомеры пероксидаза инертные -белки-альбумин (пероксидаза
предварительно обрабатывалась глутаровым альдегидом в присутствии
инертных белков и сывороточного альбумина) к сефарозе и получили
высокоактивные препараты с термостабильностью, превышающей ее величину
для не-модифицированной ковалентно связанной с сефарозой пероксидазы в
500 раз. Маршалл и Рабинович [35] обнаружили значительное увеличение
стабильности растворимых конъюгатов фермента с углеводом, приготовленных
присоединением трипсина и а- и р-ами-лаз к активированному бромцианом
декстрану.
Следовательно, можно прийти к заключению, что стабильность ферментов,
ковалентно связанных с нерастворимыми носителями, определяется не только
физической или химической природой носителя, но также и характером
химической модификации фермента при ковалентном присоединении его к
носителю.
12.4. ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
12.4.1 Аффинные лиганды
Ряд примеров применения иммобилизованных ферментов в аффинной
хроматографии приведен в гл, 11. В табл. 11.1 перечислены ферменты,
функционирующие как аффинные лиганды при выделении ряда веществ, В разд.
11.3 обсуждается использование иммобилизованной нуклеазы для выделения
меченых пептидов из ее ак-
Иммобилизованные ферменты
437
тивного центра при помощи аффинной хроматографии гидролизата
ингибированной нуклеазы. Количественная аффинная хроматография позволяет
изучать взаимодействия иммобилизованных ферментов с их ингибиторами,
кофакторами и другими веществами, образующими с ферментами специфические
комплексы.
12.4.2. Исследование стабилизированных молекул ферментов и их
субъединиц
Иммобилизация позволяет изучать ферменты в условиях, ксг-торые обычно
приводят к их агрегации. Иммобилизация химотрипсина на стекле позволила
Танизава и Бендеру [49] исследовать влияние апротонных диполярных
органических растворителей на кинетику катализируемого химотрипсином
гидролиза в условиях, приводящих к агрегации свободного химотрипсина. В
ходе этого исследования было найдено, что кажущиеся константа Михаэлиса
Предыдущая << 1 .. 174 175 176 177 178 179 < 180 > 181 182 183 184 185 186 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed