Структура и функции биологических мембран - Трошин А.С.
Скачать (прямая ссылка):
Впоследствии Аззи (Azzi, 1969), исследуя флуоресценцию интактных митохондрий и их фрагментов в присутствии АНС~, обнаружил, что при введении в среду АТФ или сукцината (переход митохондрий в энергизированное состояние) интенсивность флуоресценции снижается. Добавление к митохондриальным фрагментам в анаэробных условиях кислорода в присутствии АНС- сопровождается их энергизацией и одновременным усилением флуоресценции на 20%. Изменения интенсивности флуоресценции АНС-, связанного с интактными митохондриями и их фрагментами, блокируются цианидом, антимицином А или карбанилцианид-/?-трифлуо-рометоксифенилгидразоном (КЦТФ). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что уровень флуоресценции АНС- в обоих случаях является количественной характеристикой энергетического состояния митохондрий и их фрагментов. Однако направление этих изменений противоположно. Опытами по количественному определению АНС-, связанного с мембранами и в надосадочной жидкости, было установлено, что усиление флуоресценции вызвано увеличением количества красителя, связанного с мембранами. Опыты с положительно заряженным красителем аурамином-0 показали, что энергизация мембран интактных митохондрий, индуцируемая сукци-натом, сопровождается увеличением интенсивности флуоресценции на 50% и усилением связывания красителя. Энергизация митохондриальных фрагментов приводит к снижению на 20% количества связанного аурамина-0. Поскольку фрагменты митохондриальных мембран рассматриваются как «вывернутая наружу» интактная мембрана (Lee, Ernster, 1966), становится понятно, почему они по-разному связывают краситель в энергизированном и неэнергизированном состояниях. Различия в связывании митохондриями аниона АНС и катиона аурамина-0 дают основание предполагать, что взаимодействие красителей и энергизированной мембраны является по своей природе электростатическим. В последующих исследованиях было установлено, что субстратом, связывающим АНС" в митохондриальной мембране, являются фосфолипиды (Azzi, Vainio, 1971).
Иное объяснение явлению связывания АНС- митохондриями и их фрагментами дается в работе Кулене с сотр. (1971). Они изучали изменения флуоресценции АНС- в условиях неэнзиматической генерации мембранного потенциала, вызванного выходом из митохондрий К+ под воздействием ва-линомицина или при действии переносчика протонов 4, 5, 6, 7-тетрахлор-2-трифторометилбензимидазола (ТТФБ). Генерация потенциала за счет энергии дыхания исключалась введением цианида. Интенсивность флуоресценции АНС- снижалась при появлении внутри митохондрий отрицательного потенциала и увеличивалась, когда внутреннее пространство заряжалось положительно. Авторы связывают изменение флуоресценции АНС- с генерацией мембранного потенциала. Опыты на митохондриях высших (печень крысы) и низших (дрожжи) организмов показали, что кон-формационные переходы митохондриальных мембран связаны с регуля-
64 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
цией энергетического метаболизма митохондрий и их генетической функцией (Казакова, 1972).
Установлено, что интеркалирующие в ДНК катионные красители вызывают увеличение АТФазной активности и падение дыхательного контроля интактных митохондрий печени крыс. Автор предполагает, что исследованные агенты, взаимодействуя с митохондриальной ДНК, модифицируют участки внутренней митохондриальной мембраны, расположенные близко к АТФ-синтетазе. Катионы алкалоидов: стрихнина, хинина, морфина и никотина не интеркалируют в ДНК и не вызывают подобных изменений (Беляева и др., 1974).
Использование метода инфракрасной спектрофотометрии позволило установить, что переход митохондрий из одного метаболического состояния в другое сопровождается обратимыми изменениями вторичной структуры белков митохондриальных мембран. В условиях нормального сопряжения дыхания с окислительным фосфорилированием наблюдается снижение количества белков, находящихся в Р-конформации (Graham, Wallach, 1969).
Однозначные результаты были получены также в опытах с использованием спиновой метки (Koltover et al., 1968, 1971), показавших, что конформационные изменения в митохондриях и их фрагментах возникают в ответ на добавление АТФ (переход мембран в энергизированное состояние). Этим изменениям препятствуют динитрофенол (ДНФ) и олигомицин. Структурные перестройки в мембранах находятся в строгом соответствии с изменением активности митохондриальных ферментов.
Конформационные изменения митохондриальных мембран по данным электронной микроскопии
Ленинджер (Lehninger, 1962), анализируя изменения ультраструктуры митохондрий и свойств их мембран при набухании и сокращении, указывал на отсутствие систематических электронно-микроскопических исследований этого процесса.
Этот пробел был успешно восполнен в последующие годы в исследованиях на изолированных митохондриях печени (Hackenbrock, 1965, 1966, 1968а). С помощью метода сверхскоростного взятия проб и фиксации в условиях, исключающих возникновение артефактов, были получены важные данные об обратимых ультраструктурных изменениях митохондрий в условиях, создающих сдвиги метаболических состояний, определенных Чансом (Chance, Williams, 1955). Оказалось, что каждое из четырех метаболических состояний характеризуется ультраструктурными перестройками митохондрий. Наиболее глубокие обратимые изменения конформации внутренней митохондриальной мембраны отмечались при переходе из состояния IV (наличие в среде субстрата, 02, дефицит АДФ, лимитирующий скорость дыхания) в состояние III (наличие субстрата, 02 и АДФ, обеспечивающего высокий уровень дыхания).
