Структура и функции биологических мембран - Трошин А.С.
Скачать (прямая ссылка):
КС1 (50 мМ), -№-трис(гидроксиметил)ме тил-2-аминометан сульфоновая кислота, ТЕМС (8 мМ), КН2РО* (14 мМ), MgCl2 (6 мМ), малат (3 мМ), ЭДТА (1 мМ), сахароза (20 мМ)
Добавки (конечные концентрации)
1— митохондрии (0,7 мг), 2 — KoASH (5 мкМ), 3 — АТФ (1,5 мМ), 4 — D, L-ка-рнитин (3,6 мМ), 5 — пальмитоил-карни-тин (12 мкМ), 6 — КЦТФ (0,2 мкМ)
Ч 6 3 10 12 мин
бычьего сердца связано с процессом окислительного фосфорилирования, активным транспортом Са++, неорганического фосфата и набуханием, обусловленным переносом одновалентных катионов. «Разрядка» этого состояния происходит при добавлении АДФ или Са++, а также агентов, разобщающих дыхание и фосфорилирование.
В связи с тем, что бурая жировая ткань играет важную роль в процессах теплообразования и терморегуляции (Smith, Horwitz, 1969), несомненный интерес представляет изучение структурно-функциональной взаимосвязи в митохондриях ее клеток. Имеется предположение, что норадре-налин стимулирует гидролиз внутриклеточных триглицеридов и тем самым вызывает в митохондриях разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования in vivo (Lindberg et al., 1967). Возможно, что эти изменения отражаются на ультраструктуре митохондрий бурого жира.
Свежеизолированные митохондрии в 0,25 М растворе сахарозы разобщены в результате освобождения жирных кислот при гомогенизации ткани (Hittelman et al., 1969). Состояние разобщения может быть преодолено путем инкубации разобщенных митохондрий в среде, содержащей АТФ, KoASH и карнитин, обеспечивающий перенос жирных кислот во внутреннее пространство митохондрий, где сосредоточена система |3-окисления жирных кислот (Drahota, 1970).
68 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
Были изучены (Bulychev et al., 1972) конформационные изменения изолированных митохондрий бурого жира золотистого хомячка при их переходе от разобщенного к сопряженному состоянию.
Изолированные в 0,25 М растворе сахарозы при 0° разобщенные митохондрии бурого жира имеют расширенные интеркристньш промежутки. Конденсированный матрикс состоит из гранул 50—100А в диаметре (рис. 15). Инкубация митохондрий с АТФ и KoASH без карнитина вызывает появление смешанной популяции митохондрий, характеризующейся наличием митохондрий с конденсированной и с ортодоксальной структурой. Введение в среду инкубации карнитина (в присутствии АТФ и KoASfl) обусловливает быстрое окисление свободных жирных кислот и переход митохондрий в сопряженное состояние, о чем свидетельствует разобщающий эффект КЦТФ (рис. 16). Переход митохондрий из состояния разобщения к сопряженному состоянию сопровождается также изменением уровня активности их АТФазы и скорости реакции обмена АТФ — неорганический фосфат.
Ниже показана связь АТФазной активности и реакции обмена АТФ— неорганический фосфат в митохондриях бурого жира с уровнем их энергетического метаболизма (НМФН в мг белка/мин).
АТФазная активность *
Без ДНФ
ДНФ (5 • Ю-s М)
Обмен АТФ —• неорганический фосфат
До введения карнитина (состояние разобщения)
50
49
После введения карнитина (состояние сопряжения)
120
18
Среда для определения АТФазы: КС1 (50 мМ), ТЕМС (31 мМ), MgCln (3 мМ), сахароза (5,7 мМ), малат (3 мМ), ЭДТА (1 мМ), АТФ (6,7 мМ), KoASH (5 мкМ), митохондрии (0,8 мг белка в 1 мл), pH 7,4. Температура 30°. Время инкубации 10 мин. Среда для реакции обмена АТФ — неорганический фосфат: КС1 (50 мМ), ТЕМС-буфер (50 мМ), MgCIa (5 мМ), АТФ (10 мМ), фосфат калия, меченный Р« (20 мМ), KoASH (41,2 мкМ), митохондрии (3,5 мг белка в 1 мл).
Так, разобщенное состояние митохондрий характеризуется отсутствием у АТФазы реакции на действие ДНФ. Переход митохондрий в сопряженное состояние ведет к появлению высокой чувствительности АТФазы к действию ДНФ. При переходе митохондрий в сопряженное состояние отмечается также увеличение интенсивности реакции обмена АТФ •— неорганический фосфат.
Инкубация митохондрий в присутствии АТФ, KoASH и карнитина сопровождается переходом всех митохондрий в ортодоксальное состояние, характеризующееся отсутствием увеличенных внутрикристных промежутков, переходом матрикса в высокодисперсное состояние. Изолированные митохондрии в этом состоянии сходны с митохондриями in situ (рис. 17). Действие разобщителей (ДНФ, КЦТФ и пальмитиновой кислоты) на митохондрии, подвергнутые предварительной инкубации с АТФ, KoASH и карнитином, вызывает переход их в конденсированное состояние (рис. 18). Наиболее резкие изменения ультраструктуры отмечаются при действии пальмитиновой кислоты. Проведенные опыты показывают, что изолированные митохондрии бурого жира могут находиться в двух конформационных состояниях: ортодоксальном (при сопряжении дыхания
ГЛАВА 4. КОНФИГУРАЦИОННЫЕ ПЕРЕХОДЫ МЕМБРАН МИТОХОНДРИЙ 69
Рис. 17. Ортодоксальная конформация митохондрий бурого жира после инкубации в течение 10 мин. при 30° в среде, содержащей АТФ, KoASH и карнитин (а — ув. 10 ООО; б — ув. 60 ООО)
Обозначения те же, что на рис. 15
72 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
а
е
ч
т
Ш
I dtmbj
%
ал
щ
4
38мк
III — пальмитиновой кислоты (0,7 мМ) на 3 мин , а — конденсированное состояние митохондрий (ув 10 ООО), б — конденсированное состояние митохондриальных крист, матрикс уплотнен, его объем резко уменьшен. Интеркристные промежутки имеют вид обширных вакуолей (ув. 60 ООО), Обозначения те же, что на рис. 15
