Биология в 3 томах. Tом 2 - Тейлор Д.
ISBN 5-03-003686-5
Скачать (прямая ссылка):
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 2
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 2
46 Глава 12
После автоклавирования
остудите жидкий питательный агар примерно до 50 0C (он должен быть теплым, если прикоснуться рукой). Отвинтите крышку флакона, как показано на рисунке. Чтобы не класть ее на рабочую поверхность, где она может загрязниться, во время заливки чашек придерживайте ее мизинцем.
Б
«Прокалите» горлышко флакона в течение нескольких секунд. Это делается для того, чтобы воздух выходил из флакона, и микроорганизмы не попадали внутрь. (При этом микроорганизмы не погибают — для этой цели нужно прогревать очень долго.)
В
Медленно вылейте расплавленный агар (примерно 15-20 см3) в чашку Петри, приподняв крышку насколько это необходимо. Не наливайте агар на бортики чашки (если это случилось, залейте другую чашку). Закройте крышку и дайте агару остыть.
Крышка —¦ Донышко
Чашки подсушивают, поместив донышко на крышку, как показано на рисунке
Подсушивание нескольких чашек
Если чашка будет использована для
рассева штрихом или шпателем, то
нужно подсушить поверхность агара и крышку после того,
как агар застынет. Лучше всего подсушивать чашку
в перевернутом виде в термостате при 37 0C,
располагая ее, как показано на рисунке,
чтобы риск заражения был минимальным.
Рис. 12.3. Процедура заливки чашек.
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 2
имеют около 9 см в диаметре. Стеклянные чашки можно использовать повторно после автокла-вирования. Пластиковые чашки выбрасывают после использования; обычно их автоклавируют, чтобы уничтожить культуру. При этом они плавятся. Чашки покупают в запечатанных упаковках, которые стерилизованы гамма-облучением. Крышки препятствуют загрязнению чашки, однако молекулы газов могут диффундировать между внутренним объемом чашки и окружающей средой через микроскопические неровности в местах соприкосновения донышка с крышкой. Поэтому кислород имеет доступ к культуре, а двуокись углерода выводится наружу.
Процедура заливки расплавленного питательного агара («заливка чашки») представлена нарис. 12.3. Подразумевается, что агар был приготовлен в небольших флаконах (флаконы Маккартни).
12.4. Методы инокуляции
Во избежание загрязнения при введении небольшого количества микроорганизмов в питательную среду — инокуляции (или посева) — необходимо использовать асептические методы. Процедуры посева различаются в зависимости от типа среды (жидкой или твердой).
12.4.1. Посев на твердую среду
Посев штрихом, или посев разведением
Метод представлен на рис. 12.4. Он применяется для выделения чистых колоний бактерий из смеси бактерий. Для посева используют проволочную петлю, которую сначала нужно прокалить, как показано на рис. 12Л,А, чтобы про-стерилизовать. Затем с помощью петли берут тонкую пленку жидкой суспензии или небольшое количество твердого материала, содержащего исследуемые микроогранизмы, из предварительно выращенной культуры или другого источника микроорганизмов. Петлей мягко проводят по поверхности среды, делая серии штрихов. После каждой серии штрихов чашку немного поворачивают, так чтобы в каждой новой серии распределялись бактерии из предыдущей серии штрихов, истощая таким образом штрихи до отдельных бактерий (рис. 12.4). (Не надейтесь что-нибудь увидеть на финаль-
_Микробиология и биотехнология 47
ных штрихах до окончания времени инкубации!) Когда метод отработан, штрихи можно делать очень быстро.
С помощью этого метода можно выделять бактерии из естественных мест обитания, например из почвы, молока, воды. Образцы твердых субстанций, таких как почва, лучше суспендировать в небольшом количестве воды, либо предварительно проинкубировать в жидкой среде. Безопасным источником для рутинной работы является пастеризованное молоко. Перед тем как проводить эксперименты с бактериями или грибами, следует ознакомиться с инструкциями и правилами безопасности, чтобы снизить до минимума риск культивирования вредных организмов.
Посев на поверхность агара
Этот метод проиллюстрирован на рис. 12.5. Он удобен для посева микроорганизмов из жидкой суспензии на твердую среду. Метод применяется для определения числа жизнеспособных клеток в пробе после серийных разведений (см. разд. 12.6.1). Его можно использовать также для получения сплошного «газона» микроорганизмов на поверхности агара после густого посева. Это удобно при анализе активности ингибиторов, таких как антибиотики или дезинфицирующие вещества, которые добавляют в сделанные в агаре углубления либо наносят на диски из фильтровальной бумаги, размещенные на поверхности агара. Ингибитор диффундирует через агар, образуя зону подавления роста вокруг отверстий или дисков фильтровальной бумаги, которая видна после инкубации. Диаметр зоны может служить мерой степени ингибирова-ния.
Посев заливкой
Этот метод, альтернативный методу посева на поверхность агара, используется для инокуляции клеток из жидкой культуры, а также для подсчета жизнеспособных клеток. Поскольку клетки распределены по всей среде, а не только по поверхности агара, можно подсчитать гораздо большее их количество — до 1000 колоний на чашку. Однако размеры выросших колоний значительно меньше (рис. 12.6).
