Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
с кислородом, можно устранить, насыщая пробу кислородом до ее введения в
измерительную ячейку. В работе [6] предложена ферментная мембрана с
высокой растворимостью кислорода в ней. Такую мембрану можно насыщать
кислородом до экспозиции электрода в пробе, а затем вводить в
измерительную систему пробы, не содержащие кислород.
Однако использование ферментных электродов, работающих в динамическом
режиме, для контроля технологических процессов вызывает затруднения.
Важным преимуществом динамического режима является легкость
переградуировки в ходе измерений, но для использования его в
технологическом контроле требуется автоматический отбор проб.
Проблему автоматического пробоотбора при контроле ферментационных
процессов с помощью ферментных электродов можно снять, конструируя
электроды специально для работы в биореакторе in situ. Однако в этом
режиме работы возникают новые проблемы, также требующие разрешения. К ним
относятся: 1) обеспечение стерильности проб; 2) несовместимость
непрерывности измерений со стационарным характером сигнала,
соответствующего концентрации определяемого вещества; 3) необходимость
исключить предварительную обработку пробы, например разбавление либо
добавление кислорода или других субстратов используемой ферментативной
реакции; 4) перегруппировка в процессе работы.
В данной главе описано два принципиальных подхода к решению проблемы
непрерывного действия глюкозных электродов in situ в биореакторе:
кислородная стабилизация и внешнее буферирование глюкозных электродов. В
системах обоих типов микроокружение ферментов контролируется оператором
так, чтобы компенсировать неблагоприятные для фермента условия.
19.2. Кислород-стабилизированный глюкозный электрод
Суммарная ферментативная реакция, протекающая в глюкозном электроде на
основе глюкозооксидазы с кагалазой, описывается уравнением
P-D-глюкоза + V2O2 глюконат + Н + .
Ферментные электроды для контроля in situ
283
ADOT°/o мкА JkA
Глюкоза, г/л
Рис. 19.1. Стационарный отклик глюкозных электродов на возрастающие
концентрации глюкозы в фосфатном буфере, а: электрод, зависимый от
диффузии кислорода; б: кислород-стабилизирован-ный электрод с внутренним
парциальным давлением, соответствующим 50% величины, достигаемой при
насыщении электрода воздухом, в: кислород-стабилизированный электрод с
внутренним парциальным давлением, соответствующим 100% при насыщении
электрода воздухом. Сплошная линия: парциальное давление кислорода в
пробе соответствует 100% при насыщении воздухом; штриховая линия:
парциальное давление кислорода в пробе соответствует 50% величины,
достигаемой при насыщении воздухом.
Растворимость кислорода в воде составляет примерно 0,25 мМ, а величина Км
относительно кислорода для глюкозооксидазы необычайно велика-около 0,5 мМ
[5]. Для того чтобы отклик электрода на увеличение концентрации глюкозы
был линеен, реакция на электроде должна контролироваться скоростью
диффузии глюкозы в ферментный слой. Однако из-за высокого (по отношению к
низкой растворимости кислорода) значения Км отклик электрода становится
нелинейным при концентрации глюкозы выше ~1 r/л (рис. 19.1, а).
Концентрация кислорода в ферментере обычно намного ниже и может даже
приближаться к нулю, вследствие чего ферментативная реакция из
лимитируемой глюкозой становится лимитируемой кислородом в неопределенной
точке. Таким образом, глюкозный электрод, зависящий от диффузии
кислорода, непригоден для работы в ферментере in situ.
Для решения этой проблемы в работе [3] был предложен принцип кислородной
компенсации ферментативной реакции (рис. 19.2). Глюкозооксидазу (ЕС
1.1.3.4) из Aspergillus niger и каталазу (ЕС 1.11.1.6) из печени быка
иммобилизуют совместно на платиновой сетке, сшивая их глутаровым
альдегидом в сывороточном альбумине. Далее сетку помещают вблизи
чувствительной к кислороду мембраны кислородного электрода. Если при
сборке электрода фермент был загрязнен микроорганизмами, его необходимо
дезинфицировать, погружая, например, в 2,5%-ный раствор глутарового
альдегида. Наконец, стерильный узел помещают в автоклавированный корпус
электрода с ацетилцеллюлозной мембраной на торце. Для уменьшения отклика
электрода сетку с ферментным слоем следует плотно прижать к
ацетилцеллюлозной мембране. Платиновый электрод биосенсора включается в
электрохимическую цепь как анод (рис. 19.2). При диффузии глюкозы в
ферментный слой кислород потребляется в ферментативной реакции со
скоростью, пропорциональной скорости поступления
284
Глава 19
Рис. 19.2. Схема кислород-стабилизированно-го глюкозного электрода. 1-
иммобилизованные ферменты; 2 - платиновая сетка; 3 -тефлоновая мембрана
кислородного электрода; 4-опорное напряжение; 5- дифференциальный
усилитель; 6-контроллер, поддерживающий электролитический ток на уровне,
соответствующем нулевой разности напряжений (U); 7-источник напряжения в
электролитической цепи; 8 платгшовая спираль вокруг электрода; 9 -
