Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
микроамперметр.
4
глюкозы, которая в стационарном состоянии пропорциональна концентрации
глюкозы в анализируемом растворе.
Сигнал кислородного электрода сравнивают с постоянным опорным сигналом.
Протекание ферментативной реакции приводит к расходованию кислорода и,
соответственно, изменению измеряемой разности потенциалов. Электронная
цепь генерирует ток, проходящий через анод, на котором иммобилизован
фермент; при электролизе воды на поверхности платины образуется кислород.
Последний диффундирует в ферментный слой, тем самым снабжая
ферментативную реакцию кислородом. Ток электролиза контролируется
разностью двух указанных потенциалов так, чтобы скорость образования
кислорода возрастала, пока разность не упадет до нуля. Таким образом,
парциальное давление кислорода в ферментном слое поддерживается на
постоянном уровне, не зависящем от концентрации глюкозы, хотя чем выше
скорость реакции, тем больше ток электролиза. Катодом в данной
электролитической цепи служит платиновая проволока, намотанная на корпус
электрода.
Ферментативные и электрохимические реакции, протекающие в кислород-
стабили-зированном электроде, суммированы ниже:
с6н12о6 + о2 + н2о ^козооксидаза^ с6н12о7 + н2о2,
НгОг каталаза^ 1/202 + н20,
Анод: Н20 -> 7202 + 2Н+ + 2е",
Катод: 2Н+ + 2е~ -" Н2.
Суммарная реакция: С6Н1206 + Н20 -* С6Н1207 + Н2.
На каждую окисленную молекулу глюкозы через электрохимическую цепь
проходит два электрона. Таким образом, при отсутствии обмена кислородом
между ферментным электродом и образцом ток электролиза должен быть мерой
концентрации глюкозы. Линейная зависимость тока электролиза от
концентрации глюкозы показана на рис. 19.1,6 и в.
Один из способов минимизации обмена кислорода заключается в использовании
внешнего кислородного сенсора, чтобы получить опорный сигнал для контроля
электролиза. В принципе это возможно, однако при контроле ферментационных
Ферментные электроды для контроля in situ
285
процессов концентрация кислорода во внешней среде может быть очень
низкой, что существенно уменьшает диапазон величины отклика, поскольку
парциальное давление кислорода в ферментном слое мало (ср. рис. 19.1,6 и
в). При более высоком опорном напряжении давление кислорода в электроде
можно повысить до значений, более высоких, чем при насыщении электрода
воздухом. Таким образом можно расширить область линейности отклика
ферментного электрода.
Если парциальное давление кислорода в электроде выше, чем в пробе,
возникает систематическая погрешность, обуславливаемая диффузионной
утечкой электролитического кислорода в анализируемый раствор. Для
компенсации этого эффекта в работе [4] был разработан специальный метод
обработки данных. Исправленная концентрация глюкозы определяется
выражением
S = (J - /cD)(pBHyTp - pmcJ/kG,
где S- концентрация глюкозы, г/л; 1- ток электролиза, мкА; кп-
коэффициент массопереноса, мкА/% парциального давления при насыщении
воздухом); /;внутр - /;внсш -внутреннее и внешнее парциальное давление
растворенного кислорода соответственно (в % от величины, соответствующей
насыщению воздухом); ка - чувствительность электрода при рвкутр = рвнеш,
мкА/лт-1.
На рис. 19.3 показана зависимость сигнал-время для этого электрода.
Видно, что постоянная времени (tg5) ферментативной реакции составляет
около двух минут. Однако поскольку система контроля внутреннего
парциального давления кислорода еще не оптимизирована, постоянная времени
установления стационарного сигнала электрода достигает 5-10 мин.
Рассматриваемый электрод использован для контроля концентрации глюкозы в
процессах, протекающих в Е. coli К12 при катаболическом подавлении, при
котором значительное количество глюкозы превращается в ингибиторные
продукты анаэробного энергетического метаболизма, хотя концентрация
глюкозы поддерживается ниже 1 г/л. В первых экспериментах по контролю
концентрации глюкозы был обнаружен ярко выраженный дрейф чувствительности
электрода [1]. Несколько неожиданное увеличение чувствительности
электрода в первые часы протекания процесса привело к тому, что
концентрация глюкозы в ферментере стабилизировалась на уровне 0,5 г/л при
установке контроллера на 1 г/л. Такое увеличение чувствительности
электрода никогда не наблюдалось, пока измерения проводили в буферных
растворах.
Причина повышения чувствительности электрода в течение первых часов его
Рис. 19.3. Изменение сигнала во времени для кислород-стабилизированного
глюкоз-ного электрода в фосфатном буферном растворе при pH 7,0. Стрелками
показаны моменты добавления глюкозы (увеличение концентрации на ~ 1 г(л).
Время, мин
286
Глава 19
работы в биореакторе вполне объяснима. При сборке электрода фермент был
инфицирован бактериями (главным образом стафилококками), имеющимися на
руках. Пока электрод использовали в буферном растворе, эти бактерии не
росли и их было слишком мало, чтобы влиять на функционирование электрода.
Когда электрод переместили в ферментер со средой, способствующей росту,
