Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
устранения этих недостатков-это разработка методов электрохимического
иммуноферментного анализа, как потенциометрических, так и
амперометрических. Образование комплекса антиген - антитело проводят вне
сенсорной системы. После завершения инкубационного периода добавляют
субстрат фермента-маркера и с помощью сенсора следят за скоростью
превращения субстрата, используя щелочную фосфатазу в качестве фермента-
маркера, глюкозо-6-фосфат как субстрат и сенсор глюкозы. При помощи
Glukometer можно определить от 1,6 до 16 нг фактора VIII, связанного с
антигеном в плазме крови человека [52].
Амперометрическое детектирование супероксид-аниона, образующегося при
взаимодействии нейтрофилов с абсорбированным на поверхности электрода
IgG, открывает, по-видимому, новые возможности для создания
иммуноэлектродов более прямого действия ([14]; см. также гл. 4).
18.2.4. Активность ферментов
Определение активности ферментов в физиологических жидкостях является
быстро развивающийся областью клинической диагностики. Повышенная
ферментативная активность, обнаруживаемая в крови, сыворотке, плазме или
моче, свидетельствует об утечке ферментов из поврежденных тканей и
клеток. При контроле ферментационных
18*
276
Глава IS
процессов большое значение имеет измерение активности промышленных
ферментов, например протеаз или амилаз. Принцип действия сенсоров для
определения активности ферментов состоит главным образом в измерении
начальной скорости превращения субстрата исследуемым ферментом, который
добавляют в рабочий раствор, насыщенный субстратом. Высокая концентрация
субстрата необходима, чтобы протекала реакция нулевого порядка, для
которой скорость превращения субстрата зависит только от активности
фермента. В настоящее время серийно выпускается только один автономный
ферментный сенсор, предназначенный для определения а-амилазы (фирма Fuji
Electric, Япония).
18.2.4.1. Лактатдегидрогеназа. Лактатдегидрогеназа (LDH) представляет
собой тетрамер, образующий пять изоферментов, которые различаются по
структуре субъединиц и электрофоретической подвижности. В клетках
млекопитающих LDH локализована только в цитоплазме и при повреждении
клеток (заболеваниях печени и сердца) легко из нее высвобождается. Общая
активность LDH в сыворотке имеет важное клиническое значение при
диагностике различных заболеваний, таких, как острый инфаркт миокарда,
застойные болезни сердца, злокачественное малокровие и гепатит.
Нормальные содержания LDH в сыворотке крови взрослых мужчин и женщин
находятся в пределах 63-155 и 62-131 ед. активности/л соответственно.
С помощью сенсора на основе пируватоксидазы (ЕС 1.2.3.3), работающего по
принципу максимального уменьшения тока, определили активность LDH в
сыворотке крови человека в пределах 25-135 ед. активности/л [40].
Предложенный в работе [41] сенсор с иммобилизованной лактатооксидазой
позволяет последовательно определять лактат и LDH. Минимальная
определяемая активность LDH составляет 1 ед. активности/л. Для десяти
последовательных измерений относительное стандартное отклонение равно
2,6%. Общая продолжительность измерения активности LDH 5 мин. Если
проводить десять измерений в день, сенсор работает стабильно в течение
двух недель. При определении активности LDH в сыворотке в диапазоне от
138 до 414 ед. активности/л коэффициент корреляции с данными обычного
метода составляет 0,995.
Автономные LDH-анализаторы до сих пор неизвестны. Однако L-
лактатанализато-ры фирм La Roche, OMRON, Yellow Springs Instruments
Corp., а также Glukometer нетрудно приспособить для измерения активности
LDH (см. также раздел 18.2.1.10). Правда, могут возникнуть проблемы,
связанные с присутствием лактата в сыворотке и с тем, что в
катализируемой LDH реакции образуются относительно малые количества
лактата, поэтому может потребоваться стадия предварительной инкубации.
18.2.4.2. Амилазы. Амилазы катализируют гидролиз олигосахаридов и
полисахаридов (крахмал и гликоген). а-Амилаза дает главным образом
мальтозу и некоторые другие олигосахариды (4-12 глюкозных остатков).
Определение а-амилазы в крови и моче имеет решающее значение при
диагностике острых панкреатитов. В норме активность а-амилазы в сыворотке
находится в пределах от 60 до 150 ед. активности/л.
Для определения активности а-амилазы в сыворотке применяют различные био-
сенсорные системы. В серийном анализаторе фирмы Fuji Electric [50]
используется GOD-сенсор, при помощи которого находят сначала концентрацию
эндогенной глюкозы в анализируемой пробе и затем после добавления
мальтопентаозы и фиксированного количества а-глюкозидазы (мальтазы, ЕС
3.2.1.20), определяют активность а-амилазы. Однако стоимость анализа
довольно велика из-за большого расхода растворимого фермента и специально
приготовленного субстрата. Кроме того, метод дает неверные результаты при
высокой концентрации эндогенной глюкозы. Более эффективный подход, по-
видимому, заключается в использовании биферментных сенсоров с
