Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
число бактериальных клеток настолько увеличилось, что они уже могли
конкурировать с глюкозооксидазой за потребление глюкозы, которая
диффундировала в электрод. Это не влияло бы на функционирование
электрода, если бы обе реакции имели идентичную стехиометрию. Однако в
случае реакции, катализируемой глюкозооксидазой, на одну молекулу глюкозы
расходуется 1/2 молекулы кислорода, тогда как окисление кислорода в
процессе дыхания бактерий описывается уравнением
С6Н1206 + 602 -> 6С02 + 6Н20.
При использовании глюкозы для роста расходуется половина этого количества
кислорода. Таким образом, электрод на основе чисто дыхательного процесса
обладает в 12 раз более высокой чувствительностью, чем глюкозооксидазный
электрод. В результате инфицированный электрод имеет промежуточную
чувствительность в зависимости от соотношения протекающих на нем реакций.
19.3. Принцип действия ферментного электрода с внешним буферированием
Основным ограничением ферментных электродов, используемых in situ,
является то, что перед анализом пробу нельзя обрабатывать, например
разбавлять, изменять pH или добавлять косубстраты ферментативной реакции.
Для решения этих проблем, а также предотвращения возможного накопления
ингибирующих продуктов в работе [2] был предложен принцип внешнего
буферирования ферментного электрода. Этот принцип был использован для
определения глюкозы. Вскоре было найдено, что кислород для ферментативной
реакции можно было бы подавать из потока буферного раствора, однако
отклик такого электрода является нелинейным. При использовании для
определения глюкозы описанной выше системы кислородной стабилизации этот
электрод работал лучше.
Конструкция глюкозного электрода с внешним буферированием и
электролитическим генерированием кислорода схематически показана на рис.
19.4. Фермент и электролитическая система идентичны описанным выше.
Однако в данном случае ферментный диск находится в ячейке, образованной
двумя найлоновыми сетками (15 меш), которые плотно прижаты
ацетилцеллюлозной мембраной к поверхности кислородного электрода. Эта
ячейка снабжена каналами ввода и вывода буферного раствора, сделанными из
шприцевой иглы из нержавеющей стали внутренним диаметром 1 мм и
соединенными тефлоновой трубкой с отсасывающим или подающим насосом.
Температуру буферного раствора поддерживают выше комнатной, чтобы
избежать забивания системы воздушными пузырьками.
Глюкоза диффундирует через ацетилцеллюлозную мембрану и смешивается с
турбулентным буферным потоком в ферментной ячейке. Таким образом, при той
же концентрации глюкозы в пробе реальная концентрация глюкозы, при
которой работает рассматриваемый электрод, значительно ниже, чем в
предыдущем случае. Это приводит к расширению диапазона линейности отклика
электрода. Величина этого диапазона зависит от скорости буферного потока:
при низких скоростях (0,042 мл/мин) она составляет 0-10 г/л, а при
высоких (0,45 мл/мин)-0-100 г/л. Важной особенностью буферируемого
глюкозного электрода является то, что он может работать при экстремальных
значениях pH, поскольку буферный поток защищает фермент. Его
Ферментные электроды для контроля in situ
287
Рис. 19.4. Основные элементы ферментного электрода с внешним
буферированием ([2], с разрешения American Chemical Society). 1 -
кислородный электрод: 2-Pt сетка с иммобилизованным ферментом; З-Pt
спираль (катод); 4-иайлоновые сетки; 5-диализная мембрана; б-входной
поток буферного раствора; 7-выходной поток буферного раствора; 8-емкость
с буферным раствором; 9 - контроллер; 10- опорное напряжете; 11 -
самописец; I -электролитический ток; F-поток буферного раствора.
10
можно, к примеру, использовать при pH 2,0. При скорости потока 0,15
мл/мин внутренняя концентрация глюкозы составляла около 8% от внешней
концентрации. Из этого количества глюкозы около 3,75% превращалось в
глюконовую кислоту.
19.4. Компенсационные ферментные электроды для технологического контроля
Описанные выше два принципа компенсации решают некоторые проблемы
контроля ферментационных процессов. Кислород-стабилизированный электрод
без внешнего буферирования достаточно чувствителен для контроля подачи
глюкозы в процессах с угнетенным катаболизмом. Система кислородной
стабилизации делает анализ не только возможным, но и не зависящим от
концентрации кислорода в реакторе.
Глюкозный электрод с внешним буферированием дает возможность непрерывно
следить за потреблением глюкозы в процессах, в которых ее начальная
концентрация высока: если не проявляется ингибирующий эффект сахара,
начальная концентрация глюкозы может составлять 100 мг/л. В таком
электроде разбавление буферным раствором доводит концентрацию глюкозы до
значений, которые можно измерить. Кроме того, защита фермента буферным
раствором позволяет проводить анализ во вредных для фермента средах.
Основным препятствием к внедрению ферментных электродов в контроль
технологических процессов является их низкая стабильность. Уменьшение
