Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
Известны два способа определения ферментативно неактивных водорастворимых
высокомолекулярных веществ при помощи амперометрических биосенсоров:
1) Их можно расщепить на части, достаточно малые для прохождения через
мембраны, покрывающие иммобилизованный ферментный слой, где они
превращаются в электрохимически активные продукты.
2) Их можно определять с помощью иммунологических реакций, если имеются
соответствующие антитела или антигены. Предложены потенциометрические
био-
18-1145
274
Глава 18
сенсоры, в которых непосредственно регистрируют изменения плотности
заряда в результате специфического комплексообразования между каким-либо
биологически активным и определяемым высокомолекулярным веществом.
18.2.3.1. Полисахариды. Наиболее распространенным углеводом является
целлюлоза, представляющая собой полимер глюкозы, связанной 1,4-р-
гликозидными связями. Ежегодное мировое потребление глюкозы оценивается в
800 млн тонн. Еще один полимер, образуемый из глюкозы,-это крахмал, в
котором остатки глюкозы связаны в основную цепь 1,4-а-гликозидными
связями. Новый продукт биотехнологии -пуллу-лан- представляет собой
линейный полисахарид, содержащий связанные 1,6-а-глико-зидными связями
остатки мальтотриоз.
Перед анализом полисахариды гидролизуют в кислой среде до глюкозы или
расщепляют специфическими ферментами, например целлюлозами, амилазами или
пуллуланазами.
18.2.3.2. Крахмал. Серийный анализатор YSI модели 27 снабжен
глюкозооксидаз-ной мембраной, которую после специальной обработки
нетрудно приспособить для определения крахмала. При определении крахмала
используют два подхода:
1) Для гидролиза крахмала в анализаторе вводят в рабочий раствор
постоянное количество глюкоамилазы и после установления равновесия
добавляют пробу крахмала. Через 60 с считывают с дисплея количество
глюкозы, полученное при гидролизе крахмала.
2) Для внешнего гидролиза крахмала используют глюкоамилазу, одну или
вместе с а-амилазой (ЕС 3.2.1.1); затем определяют содержание глюкозы
крахмала после гидролиза. Этим методом определяют крахмал не только в
кукурузе, рисе, пшенице, картофеле, но и в различных продуктах из них-
кукурузной муке, хлопьях для завтрака, блинной муке. Диапазон
определяемых концентраций составляет от 0 до 25 ммоль/л с
воспроизводимостью +2%.
Более изящный и экономичный подход заключается в соиммобилизации
глюкозооксидазы и глюкоамилазы для определения сахаридов, проникающих
через защитную диализную мембрану, расположенную перед биферментным
слоем. Используя глю-коамилаза-глюкооксидазный электрод, с помощью
Glukometer GKM 01 непосредственно определяют крахмал в течение 0,5-1 мин
при диапазоне линейности до 0,3% (конечная концентрация) [54]. Перед
измерением в рабочий раствор вводят постоянное количество (1 ед.
активности) а-амилазы (рис. 18.7). Проблему мешающего влияния эндогенной
глюкозы решили, покрыв глюкоамилаза-глюкозооксидазный электрод защитным
ферментным слоем, содержащим глюкозооксидазу и каталазу (рис. 18.7) (см.
также раздел 18.2.1.9).
При помощи Glukometer GKM 01 с глюкоамилаза-глюкозооксидазной мембраной
на модифицированном кислородном электроде можно определять также
концентрацию пуллулана (конечная концентрация до 0,1%) [53]. При этом в
рабочий раствор добавляют постоянное количество (2 ед. активности/мл)
растворимой пуллуланазы. Анализатор использовали и для определения
растворимой целлюлозы. В этом случае в рабочий раствор вводили постоянное
количество целлюлозы (ЕС 3.2.1.4) и регистрировали количество образуемой
при гидролизе глюкозы [51].
18.2.3.3. Антигены и антитела. До сих пор не описано каких-либо серийных
био-сенсорных систем для определения антигенов и антител. В разработанных
недавно ферментных иммуносенсорах измеряют активность ферментов-маркеров,
связанных с определенным количеством антигена. Содержащий маркер антиген
и немеченый определяемый антиген конкурируют между собой за связывание с
определенными сайтами антител на мембране, покрывающей электрод.
Неизвестная концентрация немеченого антигена обратно пропорциональна
измеряемой электродом активности фермента-маркера. Однако в настоящее
время чувствительность этого метода низка по
Применение амперометрических биосепсоров в анализе
275
Крахмал, %
Крахмал
0*1
ос-Амилаза
Декстриня +
мальтоза.
0г,
Глюкоза
Глюкоза, ммоль/1
IWiOa катала-,
:|т
Н20г
Глюконо-
лактон
Электрод
@ I (got)
^Глюкоза
(GOT >Н20г4 Глюконолактон
Анализируемый раствор Защитный Мембрана
слой глюкоамилаза -GOD
Рис. 18.7. Принципиальная схема определения крахмала с помощью
многослойного сенсора с защитным слоем, устраняющим влияние глюкозы.
сравнению с хорошо отработанными методами иммуноферментного анализа.
Кроме того, невозможно провести измерения быстро, поскольку измерительная
ячейка занята в течение всего инкубационного периода (до нескольких
часов), необходимого, чтобы образовался комплекс антиген-антитело.
В настоящее время, по-видимому, единственный практический способ
