Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
71L (SRM') 5 796 57,5+8,3 4 648 10,7±3,2
C3L 4 970 23,0+5,3 2 405 69,1± 10,5
C3L (ретрансформанты) " “ 3 728 71,7±10,5
(около 80%) как у первичного трансформанта C3L-2J-1, так и у ретрансформантов (табл. 2.3). Мы не располагали вектором YEp351, исходным для 2J-1, однако имевшийся в нашем распоряжении вектор YEpl3, структурно сходный с YEp351, характеризуется относительно высокой митотической стабильностью в клетках 71L (SRM+) и существенно менее стабилен в клетках C3L (srm8) (табл. 2.3).
Таким образом, мутация srm8 сопровождается снижением митотической стабильности плазмиды YEpl3 (ori 2pm ДНК). По всей вероятности, ген SRM8 участвует в поддержании плазмид, содержащих в своем составе «п-последовательность из 2рш-плазмиды, в том числе и плазмиды YEp351, исходной для 2J-1. Соответственно мутация srm8 должна вызывать снижение митотической стабильности таких плазмид. Относительно высокая митотическая стабильность плазмиды 2J-1 в клетках srm8 по всей вероятности обусловлена присутствием в ней вставки размером около 3,5 т.п.н., которая предположительно комплементирует мутацию srm8. Иными словами, рассмотренные данные указывают на возможность наличия в составе 2J-1 клонированной последовательности гена SRM8.
В подтверждение высказанного предположения трансформанты C3LD (srm8lsrm8), получившие плазмиду 2J-1, а) менее чувствительны к у-облуче-нию (см. раздел 3), чем трансформанты того же реципиента, несущие плазмиду YEpl3 (сходную с исходным вектором для 2J-1) и б) способны спорули-ровать, в отличие от реципиентных клеток или трансформантов с YEpl3 (данные не приведены).
Таким образом, присутствие в лгшЯ-мутантных клетках плазмиды 2J-1 сопровождается устранением морфологических изменений клеток, а также восстановлением у гомозиготных диплоидов нормальной радиорезистентности и способности спорулировать. Кроме того, фрагмент ДНК, клонированный в 2J-1, по-видимому, обеспечивает относительно высокую (сравнительно с YEpl3) митотическую стабильность этой плазмиды в я/тоЯ-мутантн ых клетках, количественно соответствующую митотической стабильности YEpl3 в клетках 71L (SRM+). Перечисленные свойства 2J-1 позволяют констатировать функциональную комплементацию мутации srm8 фрагментом ДНК, клонированным в этой плазмиде. Митотическая стабильность
90
YJL076w
YJL077c YJL075c
Клонированный фрагмент ДНК
Рис. 31. Схема участка Х-хромосомы S. cerevisiae (вверху), содержащего открытые рамки считывания YJL077c (392 п.н.) и YJL076w (3566 п.н.), которые частично присутствуют в клонированном фрагменте ДНК (внизу)
5'
3'
плазмиды 2J-1 у трансформантов 71L (SRM+) неожиданно оказалась низкой (см. табл. 2.3). Природа этого эффекта нуждается в специальном исследовании. Возможно, он вызван присутствием в клетках множественных копий последовательности SRM8.
Установлены нуклеотидные последовательности длиной 760 п.н. с обоих концов клонированного фрагмента. Анализ нуклеотидной последовательности с использованием баз данных SGD (BLAST) выявил присутствие в клонированной последовательности фрагментов двух дивергентно транскрибируемых рамок считывания, локализованных на хромосоме X (как и следовало ожидать на основании результатов генетического картирования) и отстоящих друг от друга на расстояние менее 200 п.н. (рис. 31). Одна из этих рамок, YJL076w, имеет длину 3566 н., другая, YJL077C, - 392 н. Клонированная нами последовательность ДНК содержит фрагмент YJL076w, кодирующий 80% последовательности соответствующего белка, начиная с N-конца, и 38% последовательности YJL077c (вся последовательность YJL077c в 9 раз короче последовательности YJL076w).
С помощью П1ДР описанный выше клонированный фрагмент рамки YJL076w достроен до ее полноразмерной величины согласно данным банка нуклеотидных последовательностей S. cerevisiae. Затем полученную конструкцию использовали для инактивации (disruption) соответствующего хромосомного гена. Нулевой мутант по рамке YJL076w фенотипически не отличался от мутантов srm8 и оказался аллелен этим мутантам: скрещиваясь с ними, он давал диплоиды, характеризовавшиеся, как и диплоиды sim8/srm8, существенно сниженной скоростью деления, специфическими морфологическими изменениями клеток, утратой способности спорулировать. Таким образом, гену SRM8 соответствует открытая рамка считывания YJL076w.
Как следует из публикаций последних лет, гену SRM8 идентичен ген CFI1/NET1, который опосредует прохождение клеточного цикла, являясь негативным регулятором выхода из митоза (Visintin et al., 1999; Shou et al., 1999). Клетки с инактивированным геном NETI жизнеспособны, но имеют аномально вытянутую форму, часто образуют цепочки и размножаются медленно как на сбраживаемом, так и на несбраживаемом субстрате подобно описанным нами клеткам srm8. Помимо изменений регуляции клеточного цикла, у клеток netl обнаружены митохондриальные аномалии. Так, у мутанта с инактивированным геном NET1 обнаруживается снижение митохондриального мембранного потенциала (Entian et al., 1999).
91
2.2.6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНА SRM 12
(Колтовая и др., 1998а)
