Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Ген SRM12 был клонирован в составе фрагмента ДНК длиной 11,6 т.п.н. из геномного банка дрожжей, сконструированного на основе вектора р366. Рестрикционное картирование и частичное секвенирование клонированного фрагмента ДНК позволили определить его положение на хромосоме XVI S. cerevisiae. Данный фрагмент содержит несколько рамок считывания. Субклонирование показало, что ген SRM12, по всей вероятности, идентичен гену SUP110IHFI1IADAI (Horiuchi et al., 1997), кодирующему транскрипционный коактиватор и первоначально изученному в лаборатории проф. Т.Д. Фокса (Корнеллский университет, США) (Brown, 1994).
Профессор Фокс любезно предоставил нам плазмиду pNGB52, несущую клонированный ген SUP ПО, и штамм дрожжей NGB121 с инактивиоован-ным геном SUP110 (SUP 110::LEU2).Upn скрещивании этого штамма с srml2-мутантом образовывались медленно размножающиеся и не способные спорулировать диплоиды, фенотипически неотличимые от гомозигот srml2/srml2. Плазмида pNGB52 комплементировала мутацию srml2. Перечисленные данные свидетельствуют об идентичности SRM12 гену SUPUOIHFUI ADA1.
2.3. ГЕНЫ SRM И ПОДДЕРЖАНИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ СТРУКТУР В ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТКАХ
2.3.1. МУТАЦИИ SRM
И ПОДДЕРЖАНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА
2.3.1.1. Спонтанная rhcr-мутабильность мутантов srm
Частоты спонтанных мутантов rho~ в культурах клеток различных генотипов (Devin, Koltovaya, 1981; Devin et al., 1990; Девин и др., 1994) приведены в табл. 2.4, из которой видно, что изученные мутации srm снижают спонтанную rho~- мутабильность дрожжевых клеток в десятки раз.
2.3.1.2. Индукция мутаций rhcr бромистым этидием
у клеток различных генотипов
От скрещиваний каждого из мутантов srml, cdc28-srm, srm8, srml2, srmlS и srml7 с родительскими линиями 71а или 71а отобрали по 2 полных тетрады. Для каждого моноспорового клона из этих тетрад определили чувствительность к мутагенному действию БЭ. Клоны srml, cdc28-srm и srm8, по сравнению с клонами SRM+, оказались существенно менее чувствительными к мутагенному действию БЭ (Девин, Колтовая, 1986; Devin et al., 1990; Колтовая и др., 2001). Существенного влияния мутаций srml2, srml5, srml7 на г/ггг-мутабильность клеток под действием БЭ не обнаружено (данные не приведены). Мутанты, резистентные к митохондриальному мутагену бромистому этидию (БЭ) (Slonimski et al., 1968), описаны у дрожжей Kluyveromyces lactis (Brunner et al.,1973) и у S. cerevisiae (Bech-Hansen, Rank, 1972; 1973; Gouhier, Mounolou, 1973). У К. lactis мутант по гену РМА1, кодирующему
92
Таблица 2.4. Влияние мутаций srm на частоту спонтанных мутантов rho в культурах дрожжевых клеток
А. Диплоидные культуры
Генотип штаммов Число повторностей Число просмотренных колоний Частота мутантов rho , %
SRM+/SRM+ 3 2024 52,0+3,0
srml 1 srml 3 4083 1,1±0,3
cdc28-srmlcdc28-srm 4 4163 3,1+0,7
Б. Гаплоидные культуры
Генотип клонов Количество клонов Суммарное число просмотренных колоний Частота мутантов rho , %
srm8 4 7373 3,4±1,1
SRM+ 4 14 782 74,6±6,5
srml 2 4 1879 1,8±0,8
SRM+ 4 4167 82,9±5,6
srml5 3 8892 2,7±0,9
SRM+ 3 11 017 48,2±4,0
srml 7 4 5969 23,7±18,4
SRM+ 4 11 678 71,5±10,7
Н+-АТРазу плазматической мембраны, проявлял резистентность к БЭ и дефектность по транспорту ионов К (Miranda et al., 1995). Вообще, для значительной доли (10-20%) БЭ-резистентных мутантов у К. laciis имеет место дефектность по транспорту БЭ и одновременно по транспорту одновалентных катионов, особенно ионов К+. Транспорт в клетку молекул БЭ и катиона К+ зависит от мембранного потенциала и, по-видимому, осуществляется с участием одних и тех же носителей (Brunner et al., 1982; Pena, Ramirez, 1975;
1991). Поскольку у мутантов netl (-srm8) S. cerevisiae обнаруживаются изменения митохондриального мембранного потенциала (Entian et al., 1999), можно предположить, что обнаруженная нами резистентность мутанта srm8 к БЭ связана с пониженной проницаемостью клеток и/или митохондрий для красителя.
2.3.2. ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ SRM
НА МИТОТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ ХРОМОСОМ
Предпринятая оценка влияния мутаций srm на митотическую стабильность избыточных хромосом у дисомиков выявила примерно стократное повышение темпа спонтанной потери хромосомы IV у клеток srml при отсутствии существенного влияния srml на митотическую стабильность дисомиков по хромосоме VII (Devin et al, 1987; Devin et al., 1990), примерно двадцатикратное и примерно стократное повышение темпа спонтанной потери соответственно хромосомы IV и хромосомы VII у клеток cdc28-srm (Просвиро-ва, Девин, 1988; Devin et al., 1990), примерно тридцатикратное повышение
93
Таблица 2.5. Митотическая стабильность VII хромосомы у диплоидов разных генотипов
Генотип штаммов Количество проверенных клонов Частота спонтанных потерь хромосом
srml Isrml 4 (1,4+0,5) х 10-7
srml 1 SRM+ 4 (1,4+0,4) х 10~7
cdc28-srm/cdc28-srm 4 (0,9±0,3) х 1(Г7
cdc28-srm/SRM+ 4 (4,4±1,3) х 10 7
srmHlsrmS 3 (4,2±2,1) х 10~5
srm8/SRM+ 2 (1,5±0,6) х ИГ7
srm!2/srml2 4 (6.2+3,9) х 10 7
.srm/2/SRM+ 1 0,9 х КГ7
srm!5/srml5 1 1,6 х 10~7
srml7!srml7 1 2,9 х 10~7
темпа спонтанной потери хромосомы XIV у клеток srml2 по сравнению с ди-сомиками SRM+ (Девин и др., 1994). Значительно более слабое, но все-таки статистически значимое повышение величины упомянутого темпа вызывала также мутация srml5. Оценку влияния мутаций srm8 и srml 7 на поддержание избыточных хромосом провести не удалось из-за очень медленного размножения соответствующих мутантных дисомиков. Мутации srm2, srm3 и srm4 не оказывали заметного влияния на поддержание хромосом.
