Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Консервативность в эволюции последовательностей одиночных LTR предполагает и консервативность функций. Нами впервые показана активность LTR в клетках низших эукариот дрожжей - сахаромицетов. Для этого были сконструированы репликативные плазмиды, в состав которых введена последовательность HERV-K LTR клона YAC22-19 в прямой и обратной ориентации по отношению к репортерному гену лихеназы-L/cB Clostridium thermocellum (Piruzian et al.,2001). Этими плазмидами (LTRnp-LicB и LTRo6p-LicB) трансформировали клетки дрожжей штамма YPH 857.
Эффективность работы промотора HERV-K LTR в клетках трансформантов определяли качественно и количественно по активности экспрессируемой лихеназы. Для качественного теста колонии трех независимых и трех контрольных трансформантов инкубировали 3-12 ч на среде, содержащей лихенан. Ареол свечения вокруг образовавшихся колоний указывает на экспрессию гена лихеназы, находящегося под контролем HERV-K LTR-промотора (рис. 30).
Для количественного измерения активности лихеназы готовили клеточный лизат из 5 независимых трансформантов для каждой из двух ориентаций HERV-K LTR-промотора. В лизате измеряли активность лихеназы и нормировали ее на общее количество белка в клетке (табл. 1.2.).
Очевидно, что последовательность HERV-K LTR-клона YAC22-19 способна инициировать транскрипцию репортерного гена лихеназы в клетке дрожжей в качестве единственного промотора. Следовательно, промотор HERV-K LTR не является специфичным для клеток человека, а может функционировать и в низших одноклеточных эукариотах. HERV-K LTR инициирует транскрипцию в дрожжах, находясь в прямой и обратной ориентации относительно гена репортера, т.е. обладает двунаправленной промоторной активностью. Свойство двунаправленное™ было отмечено при изучении промотора HERV-K LTR в клеточной линии тератокарциномы человека. Эту способность HERV-K LTR сохраняет и в дрожжевых клетках. Сравнение активности HERV-K LTR промотора и наиболее сильных промоторов генов дрожжей Gal и TDH в опытах с репортерным геном показало, что активность промотора HERV-K LTR составляет -6,8% активности индуцибель-ного Gal промотора и -0,26% активности конститутивного промотора гена TDH (см. табл. 1.2.). Относительно слабая промоторная активность HERV-K LTR имела место и в клетках человека. Усиление промоторной активности HERV-K LTR в линии клеток человека может происходить за счет энхансер-
84
Таблица 1.2. Количественное определение активности лихеназы в клонах с плазмидами HERV-K LTRnpflM-LicB, HERV-K LTR обратн-LicB, Gal-LicB, TDH-LicB
Промотор, используемый в конструкции
Активность лихеназы, U/mg
Относительная активность по сравнению с Gal промтором
HERV-K LTR прям-LicB HERV-K LTR обратн-LicB GaZ-LicB TDHUcB
0,86±0,06
0,90±0,09
13,15+0,7
350±39
6,5%
6,8%
100%
ных последовательностей, с которыми связываются белковые факторы транскрипции (Domansky et al, 2000). В отношении дрожжей пока не известно, имеются ли белки, способные взаимодействовать с последовательностью LTR в роли промотора.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Дрожжи - популярная экспериментальная модель для изучения биологии эукариот на клеточном и молекулярном уровне. Успешное использование этой модели основывается на применимости методов классической генетики и молекулярной биологии для изучения наследственных структур и их функций. С помощью технологии рекомбинантных ДНК созданы векторы для клонирования и экспрессии чужеродных генов и высокоэффективные рекомбинантные штаммы дрожжей - продуценты гетерологичных белков, - широко применяемые в прикладной биотехнологии. Использование искусственной хромосомы дрожжей в качестве вектора клонирования протяженных фрагментов ДНК генома человека существенно ускорило выполнение проекта “Геном человека”. Последующие этапы исследований в области геномики и протеомики также включают ряд методов, разработанных в опытах с дрожжами. Например, поиск и сравнение функций гомологичных генов; экспрессия в дрожжах генов высших организмов для анализа функции их продуктов; определение взаимодействия белков с помощью дрожжевой двугибридной системы у разных или у одного и того же организма; выяснение механизмов эпигенетической наследственности, в частности, загадочных процессов “прионизации” белков.
2. МИТОТИЧЕСКАЯ ТРАНСМИССИЯ НАСЛЕДСТВЕННЫХ СТРУКТУР ДРОЖЖЕЙ И ГЕНЫ SRM 2.1. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Более полувека назад высокая изменчивость митохондриального генома дрожжей привлекла к себе интерес исследователей, породивший впоследствии несколько тысяч научных публикаций. Вместе с тем систематическое изучение генетического контроля г А (r-му та б и л ь н ост и, необходимое для по-
85
нимания причин, механизмов и биологического значения этой высокой изменчивости, долгое время не предпринималось. Не затрагивался также вопрос о наличии или отсутствии связи между rho-мутабильностью и митотической стабильностью ядерных наследственных структур клетки. Мы предприняли попытку идентифицировать ядерные гены, необходимые для высокой rho -мутабильности. Когда попытка дала положительный результат, встал вопрос о роли упомянутых генов в жизнедеятельности дрожжевых клеток.
