Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
87
Таблица 2.1. Влияние мутаций srm на скорость размножения диплоидных дрожжевых клеток (Колтовая и др., 1998b; 2001)
Генотип клеток Количество проверенных клонов Число генераций, пройденных культурами Время генерации, мин
SRM+/SRM+ 3 3-5 - 77,0±1,9
srml 1 srml 3 3-5 82,3±10,4
srmSlsrmS 3 3-5 94,8±3,6
srm8lsrm8 3 2 200,7±9,0
srml2lsrml2 4 3 -6 126,4±3,2
srml5/srml5 3 7-9 113,0+12,0
srml7/srml7 2 4 78,7±3,3
Известно, что для круглых гаплоидных клеток типично аксиальное почкование, т.е. образование новых почек парой, состоящей из материнской и дочерней клетки, вблизи места соединения последних, тогда как более вытянутым диплопдным клеткам свойственно биполярное почкование (Freifelder, 1960). В этой связи представлял интерес характер почкования клеток srm8 и srml2, форма которых заметно отличается от круглой. Наблюдая за начальным этапом образования колоний (на стадии четырех клеток), мы обнаружили, что для клеток SRM и srm5 характерно образование почек рядом с местом соединения материнской и дочерней клеток. У мутантов srml2 и srm8 довольно часто (20%) наблюдается возникновение почки с противоположной стороны от места соединения материнской и дочерней клеток. По-видимому, генам SRM8 и SRM12 принадлежит существенная роль в механизме, определяющем аксиальный характер почкования нормальных гаплоидных клеток.
2.2.3. КАРТИРОВАНИЕ МУТАЦИЙ SRM5 И SRM8
Среди продуктов мейоза у триплоида srm5/srm5/+ идентифицировали клон XI, по-видимому, являющийся дисомиком srm5{+. Клетки XI имели нормальную круглую форму, однако в постмейотическом потомстве гибрида XI и нормальной линии 7 lot, появлялись srm5 - мутантные длинные клетки. Анализ скрещиваний XI с четырьмя линиями, у которых по совокупности маркированы 15 хромосом, позволил установить у линии XI дисомию по хромосоме II, а мутация srm5 оказалась сцепленной с маркером lys2 в правом плече этой хромосомы. Дальнейший генетический анализ (табл. 2.2) подтвердил, что srm5 действительно располагается на хромосоме II, в ее правом плече, примерно на 10 сМ ближе к центромере, чем маркер tyrl (Devin et al.,
1990).
Анализ скрещиваний мутантов srm8 с дисомиками по хромосомам II, III, IV, VII, VIII, X, XIV показал, что мутация srm8 локализуется в хромосоме X. Далее анализировали скрещивания мутантов srm8 с близкородственными им штаммами-анализаторами, несущими генетические маркеры хромосомы X arg3 и ига2. Результаты тетрадного анализа, приведенные в табл. 2.2, показывают, что мутация srm8 находится на расстоянии около 10 сМ от локуса arg3 по направлению к центромере. В этом же районе хромосомы X карти-
Таблица 2.2. Генетическое картирование мутаций srm5 и srm8 (Devin et al., 1990; Арман и др., 1999)
Пара маркеров Проанализировано тетрад Соотношение типов тетрад Р : N : Т Генетическое расстояние, сМ
Iys2—srm5 133 61:0:74 27,4
tyrl-srmS 133 107:0:26 10,3
lys2-tyrl 133 41:0:94 34,8
ura2-srm8 124 33:6:85 48,8
arg3-srm8 209 163:0:46 10.6
ura2-arg3 93 28:0:65 35,0
рован ген SCP160 (Wintersberger et al., 1995). Однако плазмида с клонированным геном SCP160, предоставленная проф. Винтерсбергер, не комплементи-ровала мутацию srm8. Очевидно, гены SCP160 и SRM8 не аллельны (Арман и др., 1999).
2.2.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНА SRM5
Генетическое картирование показало, что мутация srm5 локализуется в непосредственной близости от локуса CDC28 и, возможно, даже внутри него. Результаты тестов на аллелизм (Devin et al., 1990) и на функциональную комплементацию мутации srm5 геном CDC28, клонированным в составе кольцевой плазмиды (Koltovaya et al., 1998), подтвердили, что srm5 является мутантным аллелем CDC28. В дальнейшем мутация srm5 будет обозначаться cdt'28-srm. Секвенирование показало, что мутация cdc28-srm должна вызывать в аминокислотной последовательности белка Cdc28p замену G20S (Н.А. Колтовая, личное сообщение).
2.2.5. КЛОНИРОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА SRM8
(Колтовая и др., 1998а; 2001)
Для клонирования гена SRM8 воспользовались чувствительностью клеток srm8 к повышенной температуре. Штамм C3L (МАТа srm8 1еи2) трансформировали ДНК геномной библиотеки дрожжей 2J351; среди трансформированных клонов, утративших температурочувствительность, характерную для C3L, идентифицировали варианты с морфологически нормальными круглыми клетками (клетки C3L, как и клетки других линий srm8, сильно вытянуты). Один из идентифицированных таким образом клонов, обозначенный C3L-2J-1, был подвергнут дальнейшему анализу.
Из культуры клеток C3L-2J-1 выделили плазмиду размером около
9 т.п.н., обозначенную 2J-1. Соответственно за вычетом длины ДНК вектора YEp351, клонированный фрагмент ДНК должен иметь размер около 3,5 т.п.н.
Плазмидой 2J-1 ретрансформировали клетки штамма C3L (srm8). Митотическая стабильность плазмиды 2J-1 оказалась относительно высокой
89
Таблица 2.3. Митотическая стабильность плазмид с (^-последовательностью 2|ллп ДНК (Колтовая и др., 2001)
Плазмида
УЕр13 2J-1
Штамм-реципиент Количество изученных клонов Просмотрено колоний Доля колоний, содержащих плазмиду, % Количество изученных клонов Просмотрено колоний Доля колоний, содержащих плазмиду, %
