Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
4.4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
4.4.1. Подготовка белка к анализу
Подготовка белка к анализу первичной структуры призвана свести к минимуму влияние других, более высоких уровней его организации. Иными словами, объектом анализа должна быть неупорядоченная поли-пептидная цепь без каких-либо поперечных ковалентных связей (например, дисульфидных мостиков) так, чтобы все ее звенья, все пептидные связи были в равной мере доступны действию как химических реагентов, так и ферментов. К сожалению, в полной мере исключить помехи со стороны свойственных белку нековалентных взаимодействий не удается, однако разработаны приемы, позволяющие приблизиться к этой цели.
Итак, белок должен быть прежде всего подвергнут глубокой денатурации и утратить четвертичную, третичную и по возможности вторичную структуру. Если в нем имеются дисулъфидные связи, прибегают к их расщеплению, используя, как правило, восстановление большим избытком меркаптосоединения, например дитиоэритрита или меркаптоэтанола:
3-56
65
-NH-CH-CO- -NH-CH-CO- ~
I I
CH2 CH2
I I
? HS-CH24M2-OH, SH + S’4111*-®*-0®
s Меркаптоэтанол SH S-CH2-CH2-0H
I I
CH2 CH2
I I
-NH-CH-CO- -NH-CH-CO-
Эта реакция, которую обычно проводят в условиях, обеспечивающих денатурацию белка (в 8 М растворе мочевины или в 6 М гидрохлориде гуанидина при pH 8—9), имеет своим результатом превращение остатка цистина в два остатка цистеина со свободными сульфгидриль-ными группами. Сохранять такое производное и тем более использовать его для последующих превращений нельзя, так как после удаления избытка восстановителя, что обычно достигается гель-фильтраци-
ей смеси, вновь произойдет замыкание дисульфидных связей за счет окисления свободных SH-трупп кислородом воздуха. Во избежание этого сульфгидрильные группы блокируют, обрабатывая восстановленный и денатурированный белок избытком иодуксусной кислоты, которая переводит остатки цистеина в устойчивый S-карбоксиметил-цистсин:
SH S-CH2“C00H
I I
СН2 + 1-СН2-С00Н -¦ сн2
I I
-NH—СН—СО— -NH-СИ—со-
S-Карбоксиметилцистеин
Такое превращение необратимо. Бели желательна последующая регенерация остатков цистеина, прибегают к получению S-сульфопро-изводных, обрабатывая белок сульфитом натрия в присутствии ионов меди. Получающийся при этом S-сулъфоцистсин при действии избытка меркаптосоединений количественно переходит в цистеин:
S-503H SH
!н2 HS-CHj-CHj-OH ( |
I I
-NH-CH—со- -NH-CH-C0-
S-Сульфоцистеин
бб
Несмотря иа совершенствование автоматических методов определения первичной структуры, даже в благоприятных случаях редко удается в одной цепи за один прием определить последовательность более чем 50 аминокислотных остатков. Этого достаточно для исследования небольших белков, в остальных же случаях необходимо прибегать к фрагментации полипептидной цепи несколькими методами, с тем чтобы получить систему перекрывающихся пептидов. Определение их строения и сопоставление полученных данных приводят к установлению последовательности аминокислот всей полипептидной цепи белка.
Известны ферментативные и химические методы специфического расщепления полипептидной цепи.
I
4.4.2. Ферментативные методы фрагментации полипептидной цепи
При выборе протеолитических ферментов, подходящих для избирательного гидролиза белка, особенно важна их специфичность. Как правило, пользуются так называемой первичной специфичностью про-теиназ, т.е. их способностью преимущественно атаковать пептидные связи, образованные тем или иным аминокислотным остатком. Аминокислотные остатки субстрата принято обозначать латинской буквой Р с индексами, соответствующими номеру остатка, считая от расщепляемой связи к аминному концу ("влево"). Остатки, расположенные в сторону карбоксильного конца ("вправо" от гидролизуемой связи) обозначают Р' с соответствующим индексом:
...P^-P^j-CO-NH-Pj'-Pj-Pg...
Бели использовать эти обозначения, то первичной специфичностью следует считать способность той или иной протеиназы избирательно расщеплять пептидные связи, образованные остатками Pj и Р^. Все
