Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
протеиназы, однако, имеют более или менее выраженную вторичную специфичность: скорость расщепления ими пептидной связи зависит не только от строения той аминокислоты, которая прямо участвует в ее построении своей карбоксильной или аминной группой (т.е. остатка Pj и Pj), но и от соседних аминокислотных остатков Р2, Pg, Р2', Рд и т.д.
Обычно в образовании комплекса с ферментом участвует не менее 5—6 аминокислотных остатков (см. гл. 10).
Влияние вторичной специфичности уменьшают, проводя гидролиз достаточно долго, так, чтобы расщепились и те пептидные связи, которые находятся в невыгодном для данного фермента окружении. Специфичность протеиназ редко бывает совершенно строгой: наблюда-
67
ется и расщепление не характерных для данного фермента связей, нарастающее со временем. Все это требует оптимизации условий ферментативного гидролиза полипептидных цепей.
В настоящее время для специфического гидролиза белков при определении первичной структуры наиболее часто применяют следующие протеиназы.
Трипсин. Это фермент поджелудочной железы животных, который принадлежит классу так называемый сериновых протеинаэ и специфически гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильными группами остатков аргинина или лизина (Pi = Arg, Lys). Боковые цепи этих аминокислот несут на определенном расстоянии от о-углеродного атома положительно заряженную катионную группу. Показано, что в зоне связывания субстрата последняя входит во впадину, где расположена отрицательно заряженная /^-карбоксильная группа одного из остатков аспарагиновой кислоты трипсина:
страта трипсина
Электростатическое взаимодействие между катионной и анионной группами играет определяющую роль в специфичности трипсина. Это подтверждается тем, что замена аспарагиновой кислоты в зоне связывания субстрата другим остатком приводит к утрате способности гидролизовать пептидные связи аргинина или лизина.
Блокирование е-аминогрупп лизина в атакуемом трипсином полипептиде, например ацилированием цитраконовым ангидридом (см. гл. 9), приводит к замене катионной аминогруппы на анионную (карбо-ксилатную), поэтому в соответствующем производном трипсин расщепляет только пептидные связи аргинина. Это позволяет получить более крупные фрагменты белка, которые после их выделения из гидролизата выдерживают в слабокислом растворе, что вызывает отщепление остатка цитраконовой кислоты и высвобождение е-аминогрупп лизина. Затем такие пептиды с регенерированными остатками лизина вновь расщепляют трипсином.
Аналогично можно регулировать доступность пептидных связей аргинина гидролизу трипсином. Для этого блокируют гуанидогруппу аргинина, обрабатывая белок в щелочной среде дикетоном, например диацетилом, закрепляя образующийся при этом диол образованием комплекса с борной кислотой (см. гл. 9).
Карбоксил остатка аспарагиновой ГУанидогруппа боковой цепи
кислоты в зоне связывания суб- аргинина в субстрате трипсина
68
При гидролизе белка трипсином обычно используют pH, близкий 8, температуру 37 °С и весовое соотношение фермент — субстрат 1:100, регулируя полноту гидролиза временем реакции. Нередко при гидро-. лизе трипсином расщепляются отдельные пептидные связи, соответствующие специфичности родственного фермента — химотрипсина. Это может объясняться присутствием в препарате трипсина примеси химо-трипсина или продуктов ограниченного гидролиза трипсина, однако и вполне чистый трипсин может сам по себе обнаруживать не характерную для него специфичность.
Химотридснн. Сериновая протеинаэа поджелудочной железы, структурно родственная (гомологичная) трипсину. Химотрипсин специфически гидролизует (оптимум pH вблизи 8) пептидные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина, триптофана и нередко лейцина, сравнимого.с этими остатками по гидрофобности (Pi = Phe, Туг, Тгр, Leu).
Термолизин. Металлопротеиназа, секретируемая клетками термофильной бактерии Bacillus amyloliquefaciens. Этот фермент, имеющий ион цинка в активном центре, оптимально активен при pH 6—8 и избирательно гидролизует пептидные связи, образованные с участием аминогрупп гидрофобных аминокислот — лейцина, фенилаланина, тирозина, валина, изолейцина (Р/ = Leu, Phe, Туг, Val, Tie). Фермент
может применяться даже при 60—80 ЙС.
Glu, Asp-специфичные протеиназы (эндопротеиназы Gin—С). Сери-новые протеиназы Staphylococcus aureus, а также некоторых стрепто-мицетов и термоактиномицетов. Ферменты гидролизуют пептидные связи, образованные о-карбоксильными группами остатков глутаминовой кислоты, значительно реже аспарагиновой кислоты (Р{ = Glu, Авр). Имеют в зависимости от субстрата и состава буферного раствора два оптимума pH: при 4 и 8. Характерная для этих протеиназ и весьма строго выдерживаемая специфичность хорошо дополняет специфичность других протеолитическиХ ферментов, поэтому они все шире применяются в анализе структуры..
Эндопротеинза Lys-C. Протеолитический фермент из Lysob ас ter enzynogenes, специфически гидролизующий пептидные связи, образованные карбоксильной группой лизина, но не аргинина (Pj = Lye).
