Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Степанов В.М. -> "Молекулярная биология. Структура и функция белков" -> 29

Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.

Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков — М.: Высшая школа, 1996. — 335 c.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка): strukturifunkciibelkov1996.djvu
Предыдущая << 1 .. 23 24 25 26 27 28 < 29 > 30 31 32 33 34 35 .. 140 >> Следующая

Эндопротенназа Arg-C. Протеиназа из подчелюстной железы мыши, избирательно расщепляющая пептидные связи, образованные с участием карбоксильной группы аргинина (Рг = Arg).
Можно предполагать, что будут найдены и войдут в практику фрагментации белков и другие протеолитические ферменты с четко определенной специфичностью.
4.4.3. Химические методы специфического расщепления пептидных связей
Из множества предлагавшихся в различное время методов избирательного химического расщепления пептидных связей наибольшее распространение в практике анализа первичной структуры получило расщепление бромцианом, проводимое обычно в муравьиной или три-фторуксусной кислоте. Эта реакция ведет к расщеплению пептидных связей, образованных с участием карбоксильной группы остатков метионина. Бромциан реагирует с серой тиоэфирной группы метионина, образуя сульфониевую соль. В этом промежуточном продукте положительный заряд на атоме серы индуцирует возникновение частичного положительного заряда (?+) на соседнем 7-атоме углерода боковой цепи метионина. Возникший таким образом на 7-углероде электро-фильный центр подвергается атаке кислородным атомом карбонильной группы, на котором постоянно существует частичный отрицательный заряд, усиливающийся во время реакции, что обусловлено поляризацией связи С=Я.
В результате смещение электронной плотности в этой группе и во всей пептидной связи завершается образованием ковалентной связи между т^-углеродным атомом и атомом кислорода, двойная связь С=0 переходит в простую, а связь С-N пептидной группы, обычно частично двойная, становится полностью двойной с переносом положительного заряда на ее атом азота:
СН3
СН3
S
+
s—
СН2
СН2
СН2 0*-
I II
-NH—CH-C0-NH-C
а
-NH—СН—С—NH-C
а
Имидоэфир лактона гомосерина
70
Одновременный разрыв связи S—СНг освобождает летучий метил-роданид. Получившееся в результате внутримолекулярной реакции производное имидоэфира лактона гомосерина легко гидролизуется с разрывом связи C“N, что и завершает специфическое расщепление пептидной связи остатка метионина. На С-конце вновь образовавшегося пептидного фрагмента оказывается остаток гомосерина или его лактон, легко превращающиеся друг в друга:
Фрагменты полипептидной цепи: N-концевой С-концевой
сн2 о сн2 о
I I * ы II
-NH-CH-------С=ЯН-Са -ЯН-СН-----С=0 +NH2-Ca-
С-Концевой остаток Остаток аминокис-лактона гомосерина лоты, следующей
за метионином
IT
он
| C-Концевой остаток
СНг гомосерина
I
сяа
I
-NH-CB-C00H
Метод расщепления бромцианом достаточно избирателен, затруднения встречаются лишь в тех случаях, когда за остатком метионина следуют серин или треонин. Характерно, что к расщеплению пептидных связей бромцианом прибегают при "вырезании" из гибридных генно-инженерных конструкций - пептидов или небольших белков, встроенных в структуру белка-хозяина для лучшей экспрессии в бактериальных клетках.
Среди других методов химического расщепления пептидной связи следует упомянуть более или менее избирательное выщепление остатков аспарагиновой, кислоты при кратком нагревании белка или пептида в слабокислом растворе. Видимо, внутримолекулярный катализ с участием /^-карбоксильной группы аспарагиновой кислоты, которая может быть сближена с обеими пептидными связями, образованными
71
этим остатком, ответствен за преимущественный гидролиз именно этих связей. В еще более мягких условиях при выдерживании в кислых растворах избирательно расщепляются пептидные связи Asp—Pro.
Описаны также методы специфического расщепления пептидных связей триптофана, цистеина и пролина, однако они нашли лишь весьма ограниченное применение.
4.4.4. Разделение пептидов, полученных фрагментацией полипептидной цепи
Разделение смесей пептидов, получаемых в результате ферментативного или химического расщепления полипептидной цепи белка, составляет одну из наиболее сложных, не стандартных, стадий анализа первичной структуры. Традиционная схема разделения состояла из большого числа стадий и, следовательно, была сопряжена с очень большими потерями пептидов, причем ведущую роль играла ионообменная хроматография пептидов чаще всего на сульфополистироль-ных катионитах с элюцией в градиенте pH. Метод дополняли гель-фильтрацией, хроматографией и электрофорезом на бумаге или тонкослойной хроматографией.
В последние годы доминирует фракционирование пептидов высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на сорбентах с "обращенной фазой". Последние представляют собой мелкие частицы кремнезема с большой поверхностью, к которой ковалентно присоединены углеводородные цепи различной длины. Разделение на таких сорбентах определяется гидрофобными взаимодействиями между этими цепями, содержащими 4, 8, иногда 18 углеродных атомов (С4, Се, Ci8), и гидрофобными элементами в структуре пептидов. Определенную роль играют и ионообменные эффекты. Пептиды элюируют при высоких давлениях — порядка 100 атм, используя градиент концентрации органических растворителей е различной десорбирующей способностью (метанол, ацетонитрил, изопропанол, диоксан), к которым для регулирования pH прибавляют трифторуксусную кислоту или буферные смеси.
Предыдущая << 1 .. 23 24 25 26 27 28 < 29 > 30 31 32 33 34 35 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed