Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
'Ъ-ОН + Вг-С?Я---------> ^СН“0““C=N
* ^ Л 70
Эфир изоциановой кислоты
Последний взаимодействует затем с аминогруппами лиганда L или "вставки" с образованием производного изомочевины, которое является сильным основанием и в обычном диапазоне pH несет положитель-ныи заряд:
+
+ NH2-L —> NCH-0—
NH2
С—NH-L
X У (ч
Лиганд Производное изомочевины
52
Такик образом, присоединение лиганда к сефарозе, активирован-
/ ¦
ной бромцианом, одновременно создает на матрице эквивалентное содержанию лиганда Число катионных групп. Следовательно, такой сорбент помимо биоспецифического связывания белка лигандом может проявлять свойства анионита, что необходимо учитывать при «го использовании.
Известны и другие способы присоединения лигандов к матрице,' однако в 'Каждом случав следует учитывать изменения в характере носителя, сопровождающие реакцию с лигандом, а также большую или меньшую неустойчивость образовавшейся связи, которая иногда . может вызывать постепенную "утечку" лиганда. Например, изомочеви-на может превращаться в производное гуанидина в присутствии значительных концентраций первичных аминов или аммиака, что влечет за собой отщепление лиганда. ; v
Сложнее требования, предъявляемые к лиганду. Он прежде всего должен достаточно сильно взаимодействовать с белком. Так, принято считать, что для получения сорбентов,-предназначенных для выделе--ния ферментов, в качестве лигандов могут быть использованы тЬкие ингибиторы или аналоги субстрата, которые имеют константу ингибирования (субстратную константу), т.е. константу диссоциации фермент
— лиганд,' не хуже IO”4 М. При этом учитывается, что присоединение лиганда к матрице ухудшает (т.е, повышает) константу ингибирования по крайней мере на один порядок. s
При подборе лигДндов для аффинной хроматографии ферментов приходится изменять структуру субстрата, чтобы предотвратить возможность его превращения ферментом в продукт, например, расщепления пептидного лиганда, если речь идет о хроматографии протеиназ. Очевидно, что сорбент, содержащий в качестве лиганда истинный субстрат, будет трансформирован при первом же контакте с ферментом и окажется непригодным.
При пропускании раствора, содержащего сложную смесь белков, других биополимеров, низкомолекулярных соединений, солей, пигментов и т.п., через биоспецифический сорбент, построенный по описанной выше схеме, лиганд образует комплекс только с тем белком, который имеет участок связывания, комплементарный структуре лиганда.
В результате именно этот белок удерживается аффинной колонкой, тогда как все остальные компоненты смеси проходят через нее не задерживаясь.
После промывания колонки для удаления неспецифически удерживаемых примесей белок элюируют, изменяя состав протекающего через колонку раствора так, чтобы ослабить рзаимодействие белка с лиган-
' 53
дом.' Для этого прибегают к изменению pH, добавляют к элюенту неорганические соли, органические растворители. Все эти факторы, воздействуя на структуру зоны связывания лиганда и подавляя отдельные виды белок-лигандных взаимодействий, например ионные связи и гидрофобные контакты, обеспечивают десорбцию. В отдельных случаях прибегают к аффинной элюции раствором лиганда или его аналога. Этот прием, основанный на конкуренции за связывание белка между присоединенным к матрице и растворенным лигандами, весьма специфичен и эффективен, но дорог.
В качестве примера рассмотрим применение циклопептидного антибиотика— грамицидина JS (см. гл. 2) — в качестве лиганда при аффинной хроматографии протеолитических ферментов. Он содержит ряд гидрофобных аминокислот, соответствующих специфичности многих протеиназ, и два остатка орнитина, 6-аминогруппы которых позволяют легко присоединить циклопептид к активированной бромцианом сефа-розе или другим матрицам:
NH2 со-
I I
]-ЯН-(СН2)з-СН_
NH-
Остаток орнитина, аминогруппа которого присоединена к активированной бромцианом сефарозе i;
Грамицидин S связывает протеиназы различных классов, однако он устойчив к их действию и не подвергается гидролизу, по-видимому, из-за присутствия в структуре остатков D-фенилаланина, пролина, а также из-за особенностей конформации циклопептида. Следовательно, грамицидин S является природным аналогом субстратов протеину и хорошо подходит для роли лиганда широкой специфичности. Так, при пропускании через колонку с грамицидйн-б-сефарозой сложной смеси веществ, содержащихся в культуральной жидкости одного из штаммов бактерии Bacilltis subtilis, сорбент связывает только ме-таллопротеииазу, которую удается полностью освободить от примесей и получить практически чистый белокЛ ^
