Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
56
ций белка и может, следовательно, привести к утрате специфичности антитела.
Во-вторых, использование обычных, поликлональных, антител, которые представляют гобой весьма сложную смесь молекул иммуноглобулинов различного строения, приводит к получению сорбента, в котором содержатся антитела с широким диапазоном сродства к выделяемому белку-антигену. Это затрудняет его сорбцию и в особенности десорбцию, так как диссоциация целого набора неодинаковых комплексов антиген—антитело может потребовать вариации условий элюции в весьма широком интервале, вплоть до весьма жестких. Это осложнение снимается, если доступны моноклональные антитела, представляющие собой однородные молекулы иммуноглобулина. Десорбция и в этом случае может доставлять некоторые трудности из-за прочности комплекса, однако их удается преодолеть, подавляя нековалентные взаимодействия между выделяемым белком и иммуноглобулином при пОмОщи изменения pH, ионной силы, добавления в элюент органических растворителей или мочевины.
Иммуносорбция особенно уместна как высокоспецифичный метод выделения небольших количеств особо ценных белков из сложных смесей, поскольку используемые сорбенты дороги и недолговечны из-за склонности иммуноглобулинов к денатурации. Очень важно, что к иммуносорбции можно прибегнуть даже в таких случаях, когда сведения о свойствах белка, в том числе чв о его функции, скудны4. Бели известна первичная структура, определенная по нуклеотидной последовательности гена, то возможно синтезировать ряд фрагментов его пептидной цепи и, присоединив их к белку-носителю, иммунизировать таким конъюгатом животное. Это дает возможность получить антитела к исследуемому белку, несмотря на то что он не только не выделен, но и его функция пока неизвестна. Иммуносорбенты, синтезируемые присоединением таких антител к подходящему носителю, позволяют
выделить белок.
; id
UVM , -
Ш ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИ
j ДЛЯ'ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
н JO
'Методы генной инженерии позволяют присоединять к структурному ?<Ьну белка последовательности, кодирующие такие белки или их фрагменты (домены), которые облегчают выделение конструкции в цел6м: Полученный гибридный ("химерный") белок во многих случае ях, *хотя и не всегда, жизнеспособен, причем обе части "химеры" не зависимо друг от друга свертываются в компактные структуры. Это
57
дает возможность, используя характерные свойства присоединенной к целевому белку структуры, провести специфическое выделение гибрида, после чего расщепить "шарнир", соединяющий обе его части.
Так, белки-гибриды, в которых одной, на составных частей является белок А стафилококкрв, могут быть очищены хроматографией на колонках, содержащих присоединенные ковалентно иммуноглобулины. Белок А прочно связывается с последними. Гибридные белки, в состав которых входит /^галактозидаза или ее крупные фрагменты, могут быть очищены на колонках, специфически сорбирующих этот фермент, например содержащих ковалентно связанный аналог субстрата — аминофенилтиогалактозид. По завершении очистки гибридный белок подвергают ограниченному протеолизу или расщепляют связь между объединенными в его структуре белками специфическими химическими методами, например действием бромциана, и отделяют "целевой" белок от белка-носителя, что, как правило, не составляет затруднений.
Иногда к структурному гену белка присоединяют олигонуклеотид-ные фрагменты, которые кодируют короткие аминокислотные последовательности, наращивающие этот белок с аминного или карбоксильного конца. Эти последовательности выбирают так, чтобы они не препятствовали свертыванию белка и в то же время сообщали- всей конструкции то или иное характерное свойство, которое позволяет легко выделить такую молекулу даже из очень сложной смеси. Затем эти фрагменты отщепляют в мягких условиях.
Так, присоединение к карбоксильному концу дегидрофолатрсдук-тазы Lys—Gly—Ser—Arg—Ser двух остатков гистидина дает последовательность Lys—Gly—Ser—Arg—Ser—His—His. Соседствующие остатки гистидина образуют комплекс с ионом Ni2+, который удерживается специально полученным сорбентом с хелатирующими группами. Это позволяет в одну стадию выделить клонированный E.coli фермен* из культуральной жидкости практически чистым, с 90%-ным выходом. Отщепление обоих остатков гистидина карбоксипептидазой А приводит к дегидрофолатредуктазе с С-концевой последовательностью Lys—Gly—Ser—Arg.
Предложено к аминному концу рекомбинантных белков-лимфоки-нов присоединять последовательность Asp—Туг—Lys—Asp—Asp—Asp— Asp—Asp—Lys, которую связывает специально полученное антитело. После очистки белка (модифицированного присоединением т4кой последовательности) иммуносорбцией его обрабатывают энтеропептидазой — ферментом, специфически отщепляющим этот пептид (сж. гл. 11). По-видимому, описанный подход особенно перспективен для выделения и очистки рекомбинантных белков.
