Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Тяжелые атомы (Hg, Pt, Au, U и др.), присоединенные к молекуле белка, не только создают на рентгенограмме новые рефлексы, но, обладая значительной электронной плотностью и большой рассеивающей способностью, изменяют интенсивность белковых рефлексов. Изменение интенсивности зависит от взаимного расположения тех или иных фрагментов белка и тяжелых атомов. Различие в интенсивностях отраженных лучей в дифракционных картинах нативного белка и его производных делает возможным, если известны положения тяжелых атомов, определение фазовых значений рефлексов. Применение производных белка, содержащих несколько тяжелых атомов, позволяет решить проблему фаз однозначно. Необходимым условием является полное сохранение структуры белкового кристалла при введении тяжелых атомов.
44
Метод изоморфного замещения был использован Брэггом и Пе-рутцем для расчета знаков рефлексов в дифракционной картине гемоглобина. Описание деталей этого исследования содержится в работе Д. Грина, В. Ингрэма и М. Перутца [195].
После создания метода, позволившего решить в кристаллографии белков проблему фаз и преодолеть трудности получения нужных кристаллов нативного белка и его изоморфных производных, встала задача измерения интенсивностей отражений в дифракционной картине. Она также не имела аналогий, поскольку касалась измерений, несопоставимых с кристаллографией малых молекул по числу дифрагированных лучей, многие из которых малоинтенсивны. Ощутимый прогресс в решении этой задачи наступил только в конце 1960-х годов, после создания полностью автоматизированных дифрактометров. В последующие годы сцинтилляционные счетчики, способные регистрировать отдельные кванты рентгеновского излучения, были соединены с прибором, автоматически перемещающим кристалл и детектор с одного дифрагированного луча к другому, что привело к достаточно эффективной и точной регистрации интенсивности. В последнее время усовершенствование эксперимента направлено на создание источников рентгеновского излучения повышенной яркости и монохроматичности. Однако при этом возрастает опасность радиационного разрушения образца, вполне реальная в кристаллографии белков.
Обработка данных, полученных при измерении интенсивностей огромных массивов отражений, была бы просто немыслима без использования электронной вычислительной техники. Кроме того, в ходе вычислений необходимо введение поправок на фон, на фактор JIo-рентца, учитывающий относительное время нахождения каждой узловой плоскости в отражающем положении, на фактор частичной поляризации дифрагированного луча, если подающий луч не поляризован, на поглощение, радиационное разрушение кристалла и т.д. Необходим также контроль за вычислением и устранением ошибок случайного характера. Работа по расшифровке трехмерных структур белков, начатая до появления вычислительной техники, не была бы доведена до конца, если бы такая техника не была создана во второй половине 1950-х годов. Увеличение темпа рентгеноструктурных исследований в последнее время во многом обусловлено развитием вычислительной техники, возможностью использования быстродействующих ЭВМ с большим объемом памяти и совершенными программами.
Изображение, полученное после математической обработки измерений дифракционной картины, отражает распределение электронов в кристалле. Обычно вычисляют электронную плотность в каком-то регулярном множестве точек и соединяют точки одинаковой электронной плотности линиями, получая таким образом плоские контурные карты. Расположенные в определенном порядке карты, вычерченные на прозрачных пластинках, передают распределение электронной плотности в трехмерном пространстве. Количество деталей структуры, видимых на таком изображении, зависит от количества рефлексов, использованных для построения контурных карт. При включении в
45
анализ почернений, вызванных рассеянием рентгеновских лучей под большими углами, можно видеть атомы, которые на картах электронной плотности выступают в виде отдельных пиков. При меньшем разрешении видны только группы атомов, имеющие характерное распределение электронной плотности, по которому их можно распознать. Интерпретацию карт, как правило, проводят с помощью механических атомных моделей. Точность их изготовления достаточна для воспроизведения стандартных длин связей и валентных углов, найденных в рентгеноструктурных исследованиях отдельных аминокислот и простейших пептидов. Узнавание аминокислотных остатков в белке почти всегда основывается на данных о последовательности аминокислот, определенной с помощью химико-ферментативных методов или приемов генной инженерии. Для углубленного ознакомления с теорией и современной методологией кристаллографии белка могут быть рекомендованы книги Т. Бландела и JI. Джонсона [196] и Д. Макри [197].
2.2. ТРЕХМЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ МИОГЛОБИНА И ГЕМОГЛОБИНА
Выше отмечалось, что развитие рентгеноструктурного анализа белков получило необходимый импульс в 1954 г., после того как Брэгг и Перутц впервые использовали метод изоморфного замещения для расчета знаков рефлексов в рентгенограммах гемоглобина [194]. Однако не гемоглобин оказался первым белком, трехмерная структура которого стала известной. Вследствие меньшего размера, а также благодаря более счастливому случаю с нахождением изоморфных производных и их кристаллизацией таким белком стал миоглобин. Молекула миоглобина состоит из 153 аминокислотных остатков (около 2500 атомов), образующих одну полипептидную цепь. К свернутой цепи прикреплена порфириновая плоская группа гема с атомом двухвалентного железа в центре, к которому и присоединяется молекула кислорода. Рентгеноструктурное изучение молекулы миоглобина, начатое Кендрью в 1948 г., проводилось в два этапа [198, 199]. Вначале в расчет было принято небольшое число рефлексов - несколько сотен. Этого оказалось достаточно для того, чтобы построить модель молекулы с низким разрешением. Такая модель с разрешением 6,0 А была получена в 1958 г. Кендрью и соавт. [200, 201], На ней нельзя было обнаружить не только отдельные атомы, но и боковые цепи аминокислотных остатков; модель отражала конфигурацию полипептидной цепи и местоположение группы гема, содержащей атом железа. Это был первый случай, когда удалось получить, по существу, фотографию молекулы белка, правда, недостаточно четкую.
