Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
ратных комплексов с помощью рентгеновской дифракции не представляется возможным. Д. Филлипс получил кристаллы устойчивого невалентного фермент-ингибиторного комплекса лизоцима с три-М-ацетил-глюкозамином (GlcNAc). Молекулы соединения легко диффундируют внутрь белкового кристалла по пронизывающим его каналам, заполненным водой, и располагаются в активных центрах молекул фермента. Отправным моментом исследования были данные В. Венцеля, обнаружившего, что фермент становится неактивным в присутствии GlcNAc. Эта молекула является частью гексасахарида, который в обычных условиях расщепляется ферментом. Естественно было предположить, что GlcNAc, действуя как конкурентный ингибитор, присоединяется к ферменту таким же образом, как соответствующая часть молекулы субстрата. Полученные результаты оказались весьма интересными. Во-первых, было выяснено место посадки трисахарида. Молекула GlcNAc заполняет верхнюю половину щели активного центра, связываясь с ферментом за счет слабых невалентных взаимодействий и водородных связей. Во-вторых, было показано, что образование невалентного комплекса сопряжено с конформационными изменениями фермента. Из дифференциальной картины, фиксирующей различия в распределении электронной плотности нативного фермента и его комплекса, отчетливо были видны смещения боковых цепей некоторых остатков и сужение щели при связывании GlcNAc. Необходимость изменения конформаций ферментов в процессе каталитического акта неоднократно обсуждалась в литературе и до этого. Однако впервые удалось наблюдать изменения структуры белка экспериментально и оценить их количественно. Молекула GlcNAc занимает только половину активного центра фермента. Поэтому для получения представления о структуре фермент-субстратного комплекса была построена модель, в которой к GlcNAc были добавлены еще три сахарных остатка (рис. 1.3). При построении модели Филлипс и сотрудники считали, что атомы четвертого сахарного кольца (D) будут образовывать слишком близкие, неблагоприятные контакты в том случае, если при этом не будет деформирована наиболее стабильная конформация кольца D (кресло) до напряженной конформации полукресла. В остальных участках возможность образования удовлетворительных взаимодействий была очевидной и модельный субстрат вписывался в структуру щели без изменения (рис. I. 4).
Предположение о деформации кольца D при посадке субстрата в активный центр согласовывалось с предложенным К. Верноном в 1967 г. химическим механизмом катализа лизоцима, по которому требуется ослабление расщепляемой связи между сахарными кольцами D и Е [222]. Позднее Филлипс и соавт. получили кристаллическую структуру комплекса лизоцима с аналогом переходного состояния субстрата - тет-расахаридлактоном [223]. Плоское лактонное кольцо по своему положению оказалось близким конформации четвертого кольца D-reKca-N-ацетилглюкозамина в модельном невалентном комплексе лизоцима.
Таким образом, полученные данные, казалось бы, убедительно подтверждают распространенное и сейчас представление о том, что при
52
образовании комплекса Михаэлиса в молекуле субстрата за счет невалентных взаимодействий возникает значительное напряжение и происходит серьезное искажение ее конформации в направлении геометрии переходного состояния.
Предположение о том, что фермент связывает субстрат с нарушением его конформации, было впервые высказано в 1930 г. Дж. Холдейном [224] и в 1946 г. детализировано Л. Полингом [225]. В согласии с идеей Холдейна и Полинга в концепции, предложенной в 1954 г. Г. Эйрингом, Р. Ламри и Дж. Спайксом [226], фундаментальное значение в ферментативном катализе придается напряжению и принудительной деформации субстрата, возникающим при сорбции и приводящим к перераспределению электронной плотности в определенной его части. Такая трактовка механизма биологического катализа получила название концепции "дыбы", или принципа "лилипутов”. Частичная дестабилизация невалентного фермент-субстратного взаимодействия приближает структуру субстрата к переходному состоянию и тем самым снижает активационный барьер и увеличивает скорость последующей стадии каталитического акта [227].
Рентгеноструктурный анализ белков и фермент-ингибиторных комплексов после классических работ Перутца, Кендрью и Филлипса стал развиваться быстрыми темпами во многих научных центрах, несмотря на то, что он по-прежнему оставался дорогостоящим, трудоемким и длительным. Через несколько лет стали известны третичные структуры химотрипсиногена, химотрипсина, рибонуклеазы, папаина, инсулина и многих других белков и их комплексов.
Полученные с помощью рентгеноструктурного анализа данные о пространственном строении белков оказали огромное влияние на развитие исследований во многих направлениях молекулярной биологии. Стало очевидно, что без знания пространственного строения и конфор-мационных возможностей белков нельзя понять природу и специфику их взаимодействий с другими молекулами и, следовательно, механизм их биологического действия. Структурные исследования белков вошли в качестве необходимой составной части во все биологические исследования, ставившие перед собой достаточно серьезные цели. Они привлекли большое внимание к фундаментальному вопросу молекулярной биологии о соотношении между аминокислотной последовательностью и пространственной структурой белковых молекул.
