Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Глобулярные белки в отличие от фибриллярных могут образовывать великолепные монокристаллы, в которых все молекулы идентич-
42
ны и одинаково ориентированы. Об этом свидетельствовали первые же результаты рентгеновского исследования пепсина, инсулина и гемоглобина [175-178]. Дифракционные картины от кристаллов перечисленных белков содержат огромное число рефлексов. Например, рентгенограмма монокристалла миоглобина, изучение которого было начато в 1948 г. Кендрью, насчитывает около 50 ООО рефлексов, т.е. несколько десятков рефлексов на один рассеивающий центр - атом [179]. Таким образом, в случае кристаллических глобулярных белков в отличие от волокнистых фибриллярных белков число неизвестных геометрических параметров молекулы значительно уступает числу уравнений, которые могут быть составлены. Следовательно, рентгеноструктурный анализ глобулярных белков в принципе является таким методом исследования пространственного строения, который может быть выполнен на атомном уровне, не требуя какой-либо дополнительной информации. Чтобы получить из рентгенограммы монокристалла трехмерное изображение молекулярной структуры глобулярного белка, необходимо было прежде всего найти путь к решению фазовой проблемы.
Дж. Бернал в конце 1930-х годов предложил два подхода к решению проблемы фаз в рентгеноструктурном анализе белков [180]. Оба они включали функцию Паттерсона и основывались на изменении интенсивностей отраженных рентгеновских лучей, которое обнаруживалось даже при небольших модификациях кристаллов. Первый из них, так называемый метод набухания и усадки, пытался в течение ряда лет использовать Перутц для определения фаз в дифракционной картине гемоглобина [181-187]. Заметного успеха в решении проблемы добиться не удалось. Тем не менее в этих работах Перутца были получены интересные данные, касающиеся внутреннего устройства гемоглобина. В частности, результатом наблюдения изменения интенсивностей дифракционных рефлексов, происходящего из-за диффузии солей в жидкость при кристаллизации белка, явилось правильное определение внешнего очертания полипептидной цепи макромолекулы. Полученное представление подтверждено изучением дифракционных картин кристаллических форм с разной упаковкой молекул. У. Брэггом и М. Перутцем обнаружено соответствие между рентгеновской дифракцией а-кератина и паттерсоновским синтезом гемоглобина [188, 189]. Пространственная векторная карта свидетельствовала о присутствии в структуре стержней протяженностью не менее 10,0 А, разделенных между собой фрагментами в ~ 5,0 А. Был сделан вывод о том, что форма этих стержней соответствует структуре полипептидной цепи а-кератина. Подобные стержни вскоре были найдены Кендрью в миогло-бине [190, 191]. После открытия Полингом радиальной усредненной векторной плотности патте рсоновского синтеза было высказано предположение, что гемоглобин представляет собой ансамбль а-спи-ралей.
Ю. Арндт и Д. Райли измерили интенсивность рентгеновского рассеяния под разными углами у большой серии аморфных белковых образцов, включая гемоглобин и миоглобин, и пришли к выводу, что спираль является важнейшим структурным компонентом большинства
43
из них [192]. То, что а-спираль составляет главную часть глобулярных белков, подтверждалось многими другими данными. Так, в дифракционной картине тропомиозина обнаружен интенсивный рефлекс 1,5 А -характерная особенность рассеяния а-спирали. Согласно спектрам дисперсии оптического вращения, исследованным Коэном и Сент-Дьердьи, термолизин содержит 70-80% а-спиралей [193]. Исключение, пожалуй, составляла одна рибонуклеаза, которая по данным рентгеноструктурного анализа и дисперсии оптического вращения практически не содержала этой структуры, а также других регулярно свернутых форм.
Вопрос о структурной организации молекул глобулярных белков был одним из наиболее дискутируемых в 1950-е годы. Подавляющее большинство исследователей было единодушно в своем положительном отношении к а-спиральной концепции Полинга и Кори. Выше отмечалось, что в это время для инсулина одновременно несколькими авторами были предложены совершенно различные, но практически полностью а-спиральные структуры. Даже для рибонуклеазы считалось, что регулярное свертывание боковой цепи в нативной конформации нарушается лишь в местах включения в аминокислотную последовательность остатков пролина (предполагалось, что только из-за невозможности образования водородной связи 5—>1) и цистеина.
Вторым методом, предложенным Берналом для решения фазовой проблемы рентгеноструктурного анализа белков, был метод изоморфного замещения [180]. В той форме, в какой он применялся кристалло-графами-органиками, его нельзя было использовать для белков из-за трудности получения гомогеннозамещенных молекул. Дж. Бернал исходил не из валентного связывания тяжелого атома с молекулой, как это делали Дж. Робертсон и И. Вудворд [173], а из специфического невалентного взаимодействия тяжелого атома с белком, определяемого характером профиля его потенциальной поверхности. Строго говоря, речь шла не о замещении тяжелым атомом, а о его присоединении. Оказалось возможным связать тяжелый атом с поверхностью белка без нарушения его молекулярной кристаллической структуры. Это удалось сделать Брэггу и Перутцу, которые получили изоморфные производные кристаллов нативного гемоглобина путем диффузии тяжелых атомов [194].
