Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
В то же время обнаруженные у гомополипептидов всех природных а-аминокислот многообразие форм и многочисленность влияющих на структуру факторов, а также отсутствие даже в случае простейших полипептидов должного понимания причин реализации у них различных конформаций указывали на то, что вопрос об общности структур искусственных и природных полипептидов не является столь простым, как это представлялось ранее. Предложенная Блоутом конформа-ционная гипотеза разделения аминокислот на спиралеобразующие и спираленеобразующие опиралась на ограниченный экспериментальный материал. Она не согласовывалась со многими, известными в то время фактами. Популярность этой гипотезы можно объяснить лишь отсутствием альтернатив. Структурные исследования синтетических полипептидов не оправдали первоначальной надежды найти простые корреляции между химическим и пространственным строением полипептидов. Полученные экспериментальные данные показали, что таких простых корреляций не существует даже в рамках гомополипептидов.
Глава 2
СТАНОВЛЕНИЕ МЕТОДА РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ
Изучение пространственного строения глобулярных белков в период, непосредственно следующий за открытием Полингом и Кори а-спиралей и (3-структуры (1950-е годы), может показаться на первый взгляд менее впечатляющим по сравнению со структурными исследованиями того же периода синтетических полипептидов. Однако если в то время исследователи полипептидов уже сказали все или почти все, что они могли сказать полезного о пространственной организации белковых молекул, то у ученых, занимавшихся кристаллографией глобулярных белков, решавших в 1950-е годы свои внутренние проблемы, все еще было впереди. Для того чтобы прийти к результатам, которые потом составят целую эпоху в развитии молекулярной биологии и кристаллографии макромолекул, необходимо было преодолеть целый комплекс методических трудностей. Сейчас очевидно, какая колос-
38
сальная потенция была заключена в рентгеноструктурном анализе белков и как позднее были блестяще реализованы его возможности при решении многих проблем молекулярной биологии. Тогда же об этом не догадывались не только ученые, стоящие в стороне от данного метода, но и его энтузиасты и даже непосредственные исполнители. Так, один из создателей рентгеноструктурного анализа, основатель крупнейшей школы кристаллографов, где начали изучаться белки, JI. Брэгг, всегда горячо поддерживавший М. Перутца и Дж. Кендрью, оценивал эту работу в 1947 г., как обладающую "вероятностью успеха, не отличающейся существенно от нуля" [170].
Не представляли всей сложности выбранного ими пути Перутц и Кендрью, первые определившие структуру белков на атомно-молеку-лярном уровне. М. Перутц в 1970 г. подчеркивал, что он поначалу и не думал о решении проблемы полной структуры, а Дж. Кендрью полушутя утверждал, что для него первоначальное невежество в области методики оказалось благом, поскольку оно не позволило ему осознать все трудности. Столь же откровенные и, безусловно, правдивые слова, по-видимому, могли бы сказать многие ученые, добившиеся выдающихся результатов. Часто одна из граней таланта исследователя проявляется не столько в четком представлении всей сложности изучаемого им явления и строгой оценке возникающих при этом трудностей, сколько в своевременности постановки проблемы, умении распределить трудности в определенном порядке и преодолении их не одновременно, а последовательно, зная, конечно, с чего нужно начать.
2.1. ОСОБЕННОСТИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ
Систематическая работа с белками началась в конце 1920-х годов У. Астбери, который был привлечен для решения проблемы пространственного строения шерстяных волокон У. Брэггом. Позднее в содружестве со специалистами по химии шерсти он изучал с помощью рентгеноструктурного анализа фибриллярные белки, начав с кератина (см. гл. 1). Другой выдающийся ученик школы У. Брэгга, Дж. Бернал, начал в 1934 г. изучение кристаллических глобулярных белков. Он работал с И. Фанкухеном и Д. Кроуфут (Ходжкин). Вскоре к ним присоединились М. Перутц, бывший студент Л. Брэгга, избравший в 1937 г. предметом своей диссертации определение кристаллической структуры гемоглобина, Д. Райли и Дж. Бойес-Уотсон. С 1946 г. сначала вместе с М. Перутцем, а потом самостоятельно в этой области начал работать Дж. Кендрью, также ученик Л. Брэгга, а с 1955 г. -Д. Филлипс. Если сюда же присоединить Ф. Крика, ставшего заниматься белками в 1949 г., то получим почти полный список лиц, создавших кристаллографию белка и выполнивших пионерские исследования по расшифровке трехмерных структур белковых молекул. Путь к этому прошел через решение следующих проблем: 1) получение белковых кристаллов; 2) решение проблем фаз; 3) получение изоморфных
39
тяжелоатомных производных; 4) измерение интенсивностей большого числа отражений; 5) разработка алгоритма и создание компьютерных программ; 6) построение карт электронной плотности и интерпретация результатов.
Каждая из проблем включала как чисто научные, так и многочисленные методологические и технические вопросы. Все здесь решалось впервые не только из-за уникальности объекта и его чрезвычайной сложности, но также и потому, что метод рентгеноструктурного анализа не был еще достаточно разработан. Первая трудность, с которой пришлось столкнуться, заключалась в получении белковых кристаллов нужных размеров и хорошего качества. До работы Бернала и Кроуфут с пепсином не было получено удовлетворительных дифракционных картин ни для одного глобулярного белка [42]. Дело в том, что кристаллы белков необычны в том отношении, что они содержат приблизительно 50% воды (по объему). При длительной экспозиции образец высыхал и кристалличность белка терялась. Авторы разработали метод получения увлажненных кристаллов. Во избежание гидратации образец в маточном растворе помещался в капилляр. В первой же работе был получен результат принципиальной важности. Дж. Бернал и Д. Кроуфут наблюдали четкую дифракционную картину кристаллического пепсина, которая пока еще неясным образом заключала в себе структурные детали белка вплоть до атомного уровня. Наличие на рентгенограмме огромного числа рефлексов могло иметь место только при идентичности пространственной организации всех молекул пепсина, по крайней мере в кристаллическом состоянии белка. Кроме того, удалось установить, что белковые молекулы представляют собой плотноупакованные тела глобулярной формы диаметром 25-35 А.
