Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Другая проблема, также связанная с подготовкой кристаллов к съемке, возникла значительно позже, когда в принципе была решена фазовая проблема и встала задача получения кристаллов изоморфных производных. На первых же порах, после получения прекрасных дифракционных снимков глобулярных белков, требовалось решить вопрос об их расшифровке. В чем же заключалась новизна рентгеноструктурного анализа глобулярных белков по сравнению с анализом малых молекул и фибриллярных белков? Суть рентгеноструктурного анализа любого монокристалла состоит в определении амплитуд всех дифрагированных лучей (отражений) и их фаз. Зная амплитуды и фазы, можно воспроизвести распределение электронной плотности элементарной кристаллической ячейки и, следовательно, найти ее геометрические параметры, а также параметры структуры образующих ее молекул. Амплитуды определяются по интенсивностям рефлексов, но найти фазы путем непосредственных измерений нельзя. В связи с этим как в кристаллографии малых молекул, так и в кристаллографии белков возникает так называемая фазовая проблема - основная проблема расшифровки любой кристаллографической структуры. В рентгеноструктурном анализе малых молекул для ее решения разработаны прямой метод, метод Паттерсона, метод проб и ошибок, метод изоморфного замещения. Со временем каждый из них приобрел целый ряд
40
вариантов [171]. В дифракционной картине, даваемой единичной молекулой (молекулярной трансформанте), расположение пиков и впадин чередуется. Оказалось возможным составить уравнения, связывающие фазы и амплитуды различных структурных факторов. Эти уравнения, когда их не очень много, поддаются аналитическому решению без привлечения интуитивных соображений и субъективных оценок. В результате становятся известными фазы. Такой подход получил название прямого метода.
В середине 1930-х годов А. Паттерсон разработал метод, который позволяет частично обходить проблему фаз, причем это делалось тем надежнее, чем проще молекула [172]. Метод основан на получении функции распределения (функции Паттерсона), представляющей собой ряды Фурье, в которых коэффициентами или структурными амплитудами Рш служат получаемые опытным путем значения интенсивности отраженных пучков лучей. Поскольку функция Паттерсона является
фурье-трансформантой величины Fhkl, а не Рш , ее можно рассчитать непосредственно по наблюдаемой дифракционной картине. На этой основе строятся векторные карты, дающие ориентировочное представление о структуре молекулы. Трудность в интерпретации функции Паттерсона состоит в необходимости нахождения координат п атомов из п2 ее максимумов, многие из которых сливаются из-за частого пересечения межатомных векторов. В результате метод Паттерсона оказался применимым только для монокристаллов простых молекул. Его несостоятельность для расшифровки белковых рентгенограмм была в принципе ясна уже в конце 1930-х годов. Позднее это подтвердила Кроуфут, построившая плоские и пространственные карты Паттерсона для инсулина, и Перутц, рассчитавший их для гемоглобина. ПаттерсоНовские карты белков содержали многие сотни тысяч межатомных векторов, интерпретировать которые и разрешить с их помощью отдельные пики не представлялось возможным.
В основе метода проб и ошибок лежат постулированные модели, соответствие которых реальной структуре оценивается с помощью фактора расходимости (R), определяемого экспериментальными (F3) и теоретическими (FT) значениями структурных факторов
Метод также применим лишь к малым мо-
R= X [f3]-[ft]/x[f=
hklV hkl
лекулам, поскольку вероятность угадать структуру сложной молекулы, тем более белка, ничтожно мала.
Метод изоморфного замещения уже в течение тридцати лет является основным, если не единственным, в рентгеноструктурном анализе белков. Его монополия была нарушена лишь в начале 1990-х годов (см. гл. 4). Метод предложен в 1937 г. Дж. Робертсоном и И. Вудвордом при расшифровке структуры фталоцианинов [173]. Он быстро превратился в общий метод анализа структур малых молекул, поскольку основывался на разумном предположении о том, что при
41
химическом замещении одного атома в молекуле на другой, сходный по электронному строению, например атома серы на селен, брома на йод, пространственная структура молекулы не претерпевает существенных изменений. Изоморфное производное считается совершенным, если ряд электронной плотности замещенной молекулы отличается от ряда исходной молекулы только наличием пика в положении замещения тяжелым атомом. Естественно, долгое время, пока ни для одного из белков не было известно химическое строение, мысль об использовании этого метода в кристаллографии белков никому не приходила. Таким образом, все существовавшие методы решения фазовой проблемы были созданы для малых молекул и прямо не подходили для белков. Даже сейчас возможности этих методов ограничены элементарными ячейками, содержащими не более ста атомов.
Не могли быть использованы для глобулярных белков методы рентгеноструктурного анализа фибриллярных белков. Рентгенограммы последних вследствие неполной упорядоченности и нестрогой регулярности волокон содержат небольшое число рефлексов (5-50), которые к тому же, как правило, диффузны. Они получаются за счет дифракции рентгеновских лучей на регулярных участках волокон. На основе столь бедной рентгенограммы нельзя даже в принципе выполнить полное и независимое определение на атомном уровне структуры фибриллярного белка. Иными словами, число неизвестных (координаты атомов) в этой задаче намного превышает число уравнений, которые могут быть составлены для их определения на основе известных экспериментальных данных (положений и интенсивностей рефлексов). Волокнистая структура и нерастворимость таких белков делают практически невозможной их кристаллизацию с хорошей трехмерной упорядоченностью. Поэтому с помощью анализа рентгенограмм фибриллярных белков можно преследовать лишь ограниченную цель идентификации типа регулярных структур пептидного скелета и возможного способа его аранжировки. Сначала создается ориентировочная модель, причем только регулярной части белка, рассчитывается картина рентгеновской дифракции этой модели, которая затем сопоставляется с наблюдаемой рентгенограммой. Путем изменения модели добиваются наиболее полного совпадения теоретической и экспериментальной дифракционных картин. Но и такая задача далеко не всегда решается однозначно. Поэтому при рентгеноструктурном анализе фибриллярных белков большое значение имеют дополнительные данные о структуре, полученные иным образом, с помощью привлечения спектральных методов, структурных параметров родственных молекул, информации о плотности, механических свойствах и т.д. Расчет дифракционной картины, соответствующей предполагаемому спиральному строению фибриллярного белка, выполняется на основе теории интерференции рентгеновских лучей спиральными структурами, разработанной Кокраном и Криком [77]. Обзор методов рентгеноструктурного исследования фибриллярных белков содержится в работе К. Холмса и Д. Блоу [174].
