Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Дальнейшая работа с мембранными белками - изучение их функций, механизмов действия и пространственных структур, однако, натолкнулась на большие трудности. Оказалось, что высвобождение белковых молекул из мембраны часто сопровождается необратимой денатурацией их нативных структур и, следовательно, потерей активности. В редких благоприятных случаях при солюбилизации белков в мягких условиях и при низких концентрациях функциональные свойства не пропадают, что указывает на сохранение, по крайней мере частичное, нативных конформаций. Наиболее детальная информация о белках и липидном бислое получена при изучении плазматической мембраны эритроцитов человека, содержащих гемоглобин -немембранный белок, представленный в этих клетках в наибольшем количестве [237]. Удобство данного объекта обусловлено тем, что мембраны эритроцитов, называемые "тенями", являются единственными в Клетке и их легко выделить в чистом виде с разрывом и без разрыва и даже получить вывернутыми наизнанку. При изучении теней эритроцитов впервые удалось установить, что некоторые мембранные белки пронизывают насквозь мембранный бислой, а внешняя и внутренняя стороны мембраны являются асимметричными [238]. Исследования белков плазматической мембраны эритроцитов человека
57
методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия привело к идентификации около 15 главных белков с молекулярными массами от 15 до 250 кДа. Три из них - спектрин, гликофорин и так называемый белок полосы III -составляют в сумме более 60% от массы всех мембранных белков клетки. Они по-разному связаны с мембраной и могут служить примерами трех типичных способов ассоциации белков с мембранами.
Спектрин (240 кДа) в равной мере можно считать и мембранным белком, и компонентом цитоскелета эритроцитов. Две его полипеп-тидные цепи, закрученные друг относительно друга, образуют подвижные димеры, которые посредством взаимодействий с короткими актино-выми филаментами и другими белками объединены в тетрамеры, покрывающие плотной сетью цитоплазматическую поверхность мембраны (рис. 1.5). Структурная организация позволяет спектрину регулировать подвижность белков и их распределение в плазматической мембране [239, 240].
Гликофорин - первый мембранный белок, для которого была определена аминокислотная последовательность. Этот трансмембранный гликопротеин содержит 131 аминокислотный остаток и около 100 остатков сахара; его молекулярная масса равна 30 кДа [241]. Из рис. 1.6 видно, что большая часть полипептидной цепи гликофорина находится на наружной поверхности мембраны, где локализован гидрофильный N-концевой фрагмент. C-Концевой участок цепи, также составленный преимущественно из гидрофильных остатков, погружен в цитоплазму, а гидрофобный фрагмент в форме единичной а-спирали из 20 аминокислотных остатков пронизывает неполярный липидный бислой.
Белок полосы III из мембраны эритроцитов человека представляет собой трансмембранный белок с молекулярной массой около 100 кДа (примерно 800 аминокислотных остатков). Это транспортный белок, две молекулы которого образуют анионный канал для ионов СГ и НС03, пассивно перетекающих через мембрану в соответствии с градиентами их концентраций [242-244]. Полипептидная цепь белка в а-спиральной конформации несколько раз пронизывает бислой; около трети его цепи с N-конца помещена в цитоплазму, а короткий С-концевой участок расположен во внеклеточном пространстве (рис. 1.6). Для того чтобы понять механизм функционирования транспортного белка полосы III, как и механизмы действия других мембранных белков, необходимо знать трехмерную структуру молекулы в условиях липидного бислоя. Для получения такой информации требуется, на первый взгляд, почти невозможное. Во-первых, необходимо отделить трансмембранный белок от липидов и других мембранных белков, не повредив его молекулярной трехмерной структуры, что очень трудно. Во-вторых, из выделенных белковых молекул следует получить, не нарушив их пластической, легко деформирующейся при изменении внешних условий структурной организации, высокоупорядоченный монокристалл требуе-мых размеров, что не всегда удается даже в случае водорастворимых
58
Димер
Рис. 1.5. Схема структурной организации молекул спектрина на внутренней (цитоплазматической) поверхности мембраны эритроцитов человека
Гликофорин Белок полосы III
глобулярных белков. В 80-е годы XX в. возник альтернативный подход к получению белковых объектов для рентгеноструктурного анализа, который затронул и кристаллографические исследования мембранных белков. Речь идет о генной инженерии, в основе которой лежит сайт-специфическая рекомбинация ДНК. В результате стало возможным
59
создавать целенаправленные, в том числе и искусственные, генетические программы и получать требуемые белки и их фрагменты в количествах, достаточных не только для научных, но и прикладных целей. Методы генной инженерии, однако, радикально не облегчили получение кристаллических образцов, построенных из нативных конформаций белковых молекул и имеющих четкие дифракционные картины. Тем не менее, появившаяся перспектива получения химически чистых мембранных белков, их мутантов и составных частей любой длины и с любой вариацией аминокислотных последовательностей, значительно расширила область поиска решений этой задачи.
