Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
ккал/моль ккал/моль
Asp->Ala-8 0,9 А1а-8-А1а-Ю 0,4 А1а-8-А1а-12- -0,1
Ala-110
Val---»Ala-10 3,4 А1а-8-А1а-12 0,8
Asp->Ala-12 0,3 Ala-12-А1а-110 -0,4
Arg---»Ala-l 10 0,4
тиворечат, причем существенно, одному из основных положений метода Фершта о постоянстве вкладов отдельных атомных групп боковых цепей аминокислотных остатков в стабилизацию структуры белка. Отсутствует соответствие даже при тех минимальных изменениях в последовательности, которые автором отнесены к идеальным [110]. Оказалось, что "ненарушающие делеции" Фершта , т.е. переход от объемных алифатических боковых цепей к менее объемным той же природы, не соответствуют своему названию. Аминокислотные замены, подобные Не и Ala или даже Val, сопровождаются устранением целого ряда невалентных контактов и нарушением существовавшей в локальной области нативной структуры согласованности межостаточных взаимодействий, что, в свою очередь, ведет к повышению энергии поверхностного слоя вокруг образовавшейся "пустоты", самопроизвольной переориентации ближайших боковых цепей, отвечающей изменившимся условиям, и установлению новых невалентных взаимодействий. Поскольку окружение каждого остатка в
399
трехмерной структуре белка в химическом и пространственном отношении уникально, а также учитывая взаимодействия с молекулами растворителя, то неповторимы и энергетические последствия любых аминокислотных замен. Следовательно, лежащее в основе разработанного Ферштом подхода предположение об отсутствии или незначительности кооперативного эффекта при "ненарушающих де-лециях", как и других аминокислотных заменах, противоречит собственным экспериментальным данным, касающимся стабильности барназы и многих десятков ее мутантов. Сделанные на этой основе эмпирические оценки энергетическим вкладам отдельных атомных групп белковых цепей в стабильность структуры белка вряд ли можно считать обоснованными.
Перейдем теперь к рассмотрению результатов исследования Фершта и соавт. [138, 139] кинетики свертывания и развертывания барназы и ее мутантов.
Ранее, при изучении денатурации барназы был сделан вывод, что по ходу своего развертывания белковая цепь сначала преодолевает переходное состояние, определяющее скорость процесса при всех концентрациях денатуранта (мочевины), а затем последовательно принимает ряд промежуточных форм, из которых идентифицировать удается лишь одну (1) [131]. Поэтому минимальная кинетическая схема, согласующаяся с существующими опытными данными, имеет вид:
D I TS N
Переходное состояние между I и N, не наблюдаемое экспериментом, авторы представляют флуктуирующим образованием, однако, сохраняющим, некоторые черты исходной нативной структуры (рис. 111.21) [130, 137]. Для анализа подобного состояния существует только один подход - кинетический, который и был использован при изучении процесса в направлении развертывания цепи. Такой выбор имеет то преимущество, что в этом случае процесс начинается с хорошо известной пространственной структуры белка.
Константа скорости развертывания (kD) зависит от концентрации мочевины и, согласно К. Тэнфорду, определяется по формуле:
lnkD = 1пС + mKD • [(H2N)2CO],
, н2о
где kD — константа скорости денатурации в воде, а шко — эмпирический параметр, характеризующий увеличение экспонированной растворителю поверхности белковой цепи при переходе от полностью свернутой формы к переходному состоянию [151].
Действие мутации на энергию переходного состояния относительно свернутой формы, т.е. энергию активации, AGTS_N' (рис. 111.21), рассчитывается по уравнению Аррениуса, а изменение AGxs _n’ мутанта по сравнению с AGXS_N, белка дикого типа, т.е. AAGXS_N, находится из соотношения
AAGtd-n = -KTln(kD/k'D),
400
Cffep/m/fame
flepezvfiva/r ff&wcrm
Л?/
щ L&
A&n
TS
Рис. 111.21. Изменение свободной энергии при свертывании белковой цепи барназы (концентрация мочевины <4 М), развертывании (>4 М) и в состоянии равновесия (4 М)
AGn,AGq,AG| — изменения свободной энергии нативного 'N), денатурированного (D) и промежуточного (I) состояний; AG* — энергия активации; TS — переходное состояние [139]
где AAGts_n — разность изменений энергии активации развертывания нативной барназы и мутантного белка относительно их свернутых форм (N), kD и кц — константы скорости развертывания белка дикого типа и мутанта.
Структурные изменения белковой цепи на пути от нативной конформации до переходного состояния оценивались с помощью параметра ф-гх, определяемого отношением
_ AAGts-n ^TS ~ AAGd_n ’
где AAGd_n — разность изменений свободной энергии развертывания белковой цепи, AGD_N, дикого типа и мутанта, AGryN-. При справедливости предположения об аддитивности свободной энергии развертывания значение <Pts = 0 (<pxs = 1 ПРИ свертывании) указывает на сохранение свернутой формы в месте мутации, а значение <pTS = 1 (фт8 = 0 при свертывании) — на обретение мутированным остатком конформационной свободы полностью развернутой цепи. Любые другие значения параметра фт5, отличные от 0 и 1, могут быть вызваны отклонением от аддитивного представления свободной энергии как простой суммы постоянных вкладов атомных групп, и поэтому в рассматриваемом подходе не имеют однозначной трактовки. Следовательно, при использовнии параметра фт5 для суждения о структуре переходного состояния ответ может быть получен, строго говоря, только на уровне "или-или". Иными словами, зондирование путем точечных мутаций способно идентифицировать у данного остатка лишь одно из двух конформационных состояний, реализуемых в свернутой (N) и развернутой (D) формах белка.
