Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
TSi TS2 ^ ^ медленно ^
при нестабильном промежуточном состоянии I. Переменной во всех случаях является энергия состояния D, а неизменными — от-
О о
носительная энергия состояний I, TS2 и N. При условии AGj > AGD (рис. III. 15,а) увеличение стабильности I ведет к уменьшению потенциального барьера и, следовательно, к увеличению стабильности N. Это продолжается пока AGj не станет равной AGq (рис. III. 15,5).
При AG'[ < AGd (рис. III. 15,в) скорость свертывания и стабильность N не увеличивается; промежуточное состояние I в таком случае становится доминирующей формой несвернутого белка в условиях денатурации.
В методе Фершта денатурация и ренатурация белковых цепей дикого и мутантного типов описываются, как это принято, с помощью экспериментально измеряемых констант равновесия (К) и скорости (к). Предполагая оба процесса равновесными и, следовательно, термодинамически обратимыми, что также является общепринятым, определяют изменения свободной энергии при известных величинах К и к соответственно по уравнению изотермы Вант-Гоффа
AG = -RTlnK
и уравнению Аррениуса
К = Ае~ло*/КТ,
где R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, А — пред-экспоненциальный множитель уравнения Аррениуса, AG — разница свободной энергии основных состояний, AG* — разница свободной энергии переходного и основного состояний (энергия активации).
По рассчитанным изменениям свободной энергии вдоль координаты
388
TS,
TS?
N
Рис. III.15. Диаграммы, иллюстрирующие влияние соотношения свободной энергии состояний D и I на скорость свертывания белковой цепи и стабильность состояния N
а — AGq < AGj; б — AGj} = AG j; в — AGd>AG[ [132]
Рис. III. 16. Профили изменений свободной энергии белков дикого и мутантного типов вдоль координаты ренатурации белковой цепи [110]
N
6G*
Мутант Дикий тип
реакции находятся различия в энергетических уровнях дикого и мутантного белков и строится разностная диаграмма, представленная на рис. Ш.16.
Центральная идея метода Фершта заключена, однако, не в описанной, достаточно рутинной, хотя и необходимой процедуре, а в выборе мутантов. Чтобы дать полезную информацию о стабильности и пути свертывания белковой цепи, они должны удовлетворять следующим требованиям: 1) при свертывании не отклоняться от пути ренатурации интактной аминокислотной последовательности; 2) в свернутом состоянии иметь пространственную структуру, существенно не отличающуюся от трехмерной структуры нативного белка; 3) в развернутом состоянии иметь структуру, не отличающуюся от состояния статистического клубка нативного белка; 4) на всем пути свертывания мутантные аминокислотные остатки не должны образовывать невалентных контактов с новыми партнерами [113]. Перечисленным условиям, по Фершту, будут удовлетворять мутантные последовательности с единичными заменами аминокислотных остатков на более простые, обладающие менее объемными боковыми цепями. Иными
389
словами, предполагается, что изменения в стабильности тех или иных состояний и скорости свертывания нативного белка и мутанта, отличающихся одним остатком, обусловлены влиянием той атомной группы, которая отсутствует у искусственного аналога. В этом случае при замене, например, Пе и Val оценивается вклад группы С8Н3 изолейцина интактной последовательности в значения термодинамических и кинетических параметров процесса ее ренатурации, при замене Пе на Ala — групп СШ3 СуИ2 и С8Н3, Не на Gly — всей боковой цепи изолейцина, а при замене Ser на Ala или Туг на Phe — вклады гидроксильных групп. Такой подход основывается на предположении об аддитивности невалентных взаимодействий боковых цепей, которое, при прочих равных условиях, будет тем ©олее справедливо, чем меньше различий между соответствующими остатками дикого и мутантного типов.
Привлечение к проблеме свертывания белка сайт-надравленного мутагенеза и использование уравнений равновесной термодинамики и формальной кинетики позволили Фершту и соавт. предпринять попытку решить две задачи. Первая из них основывалась на опытных значениях констант равновесия и заключалась в определении вызванных мутациями изменений в стабильности основных состояний белковой цепи. Ее цель состояла в установлении эмпирических соотношений между глобальной свободной энергией и энергией невалентных взаимодействий боковых цепей в различных областях белковой глобулы [133]. Вторая задача исходила из результатов кинетических измерений процессов свертывания и развертывания нативного белка и мутантов и имела цель обнаружить изменения энергии промежуточных состояний и энергии активации (рис. 111.16). Различия в энергетических уровнях промежуточных (AAGj) и переходных (AAG*) состояний помогали определить их положения на пути структурной самоорганизации белковой цепи. При этом каждая аминокислотная замена служила своеобразной репортерской меткой наблюдаемого изменения, происходящего на мутированном участке по ходу ренатурации или денатурации.
