Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
П5-Петля 100---104 --- --- Tyr-103
(35-Структура 105---108 --- --- Phe-106
С-Конец 109---110 lie-109 --- ---
Примечание. Подчеркнуты остатки, боковые цепи которых находятся в центре нуклеации.
Р2 и 34- Вторая нуклеация Nucl2 объединяет боковые цепи восьми гидрофобных остатков спиралей а2 и а3, складчатого листа 3i и петель Пь П2 и ^4 и> следовательно, стабилизирует среднюю часть аминокислотной последовательности барназы (табл. III. 1; рис. 1П.19). Если в Nuclj дисперсионные взаимодействия боковых цепей имеют преимущественно радиальную направленность с центром Ие-88, то в Nucl2 они образуют потенциальную поверхность сложной пространственной фигуры. В нуклеации Nucl3 (рис. 111.20) ассоциированы боковые цепи семи остатков (3-структур ((32—Э5) и П-петель (03 и П5). Центрами взаимодействий являются расположенные друг против друга боковые цепи Leu-63 и Leu-89. При попытке в общем виде отразить последствия гидрофобного эффекта на свертывание белковой цепи барназы можно сказать, что он приводит к образованию трехмерной структуры молекулы, имеющей в отношении своего главного стабилизирующего
394
фактора — дисперсионных взаимодействий — вид своеобразного сэндвича. В его центральном слое расположена (3-структурная система ((3]—(35), частично экранированная от контактов с водой с одной стороны с^-спиралью (Nuclj), с другой — неупорядоченными участками П3- и П5-петель (Nucl3), а сбоку — а2-спиралью и Пг, 04-петлями (Nucl2). Анализ трехмерной структуры барназы, который в оригинальном изложении Фершта и соавт. [137, 147] содержит ряд деталей, опущенных здесь, позволил приступить к рассмотрению следующей задачи
395
Петля 5
Рис. 111.20. Гидрофобная нуклеа-ция Nucl3 трехмерной структуры барназы [147]
Петля 3
— выбору сайг-направлен-ных единичных и мульти-плетных циклических аминокислотных замен и составлению, таким образом, набора мутантов, подлежащих биосинтезу и термодинамическому и кинетическому изучению, которое, по мнению авторов, должно привести к оп-
ределению стабильности нативной конформации белка и установлению механизма ее образования.
Отобранная совокупность объектов дальнейшего исследования составила 64 мутанта, из которых 59 отличались от дикого типа барназы одним остатком, четыре — двумя и один — тремя. Замещение произведено не только в местах скопления гидрофобных остатков (Nucli_3), но и во всех других областях трехмерной структуры. Далеко не всегда это были замены остатков с более объемными алифатическими боковыми цепями на менее объемные, типа Не на Val или Val на Ala. Часто мутировались остатки, несущие положительные (Arg, Lys) и отрицательные (Asp, Glu) целочисленные заряды, соответственно на Gly, Ala и Ala, Gly, Asn, а также остатки с гидроксильными группами (Thr, Ser, Туг) на Gly, Ala, Val, Arg, Phe. Почти во всех экспериментах денатурация белковой цепи проводилась под действием мочевины. Многие исследования показали, что свободная энергия развертывания в этом случае изменяется пропорционально концентрации денатуранта [(H2N)2CO] и может быть определена по формуле:
котором отсутствует мочевина, am — эмпирический параметр, пропорциональный увеличению экспонированной растворителю поверхности белковой цепи при денатурации [151]. Изменение стабильности структуры барназы есть разность между свободной энергией белка дикого типа и энергией соответствующего искусственного аналога
Напомним, что идея исследования стабильности пространственной структуры барназы заключалась в предположении, что при минимальном сокращении боковой цепи того или иного остатка происшедшее вследствие этого увеличение свободной энергии (AAGD) обусловлено потерей стабилизирующего вклада невалентных взаимодействий именно той атомной группы, которая исчезла в мутанте. А. Фершт, излагая основы своего метода, в частности, пишет:
(AAGd).
396
Таблица III.2
Изменения свободной энергии развертывания под действием мочевины белковой цепи барназы при уменьшении объема алифатических боковых цепей
Не---.Val Не--->А1а Val---»А1а
Номер MGd, Номер ддс;0, Номер ДДСр,
остатка ккал/моль остатка ккал/моль остатка ккал/моль
4 0,6 4 1,3 10 3,4
25 1,1 25 3,5 36 1,3
51 1,8 51 4,7 45 1,7
55 0,3 55 1,1
76 0,8 76 1,9
88 1,3 88 4,0
96 0,9 96 3,2
109 0,8 109 2,1
"К идеальным относятся мутации, которые исключают небольшие части боковых цепей, образующие простые и определенные взаимодействия, и при этом не вызывают каких-либо других изменений в структуре, кроме отсутствия взаимодействий, связанных с удаленной частью. Мы назвали такие мутации "ненарушающими делециями" [110, С. 6]. Наблюдаемые факты могут получить в методе Фершта однозначные трактовки при непременном соблюдении условия, что все замены в 64 отобранных мутантах соответствуют "ненарушающим делециям", т.е. являются идеальными. Только в этом случае изменения свободной энергии искусственных аналогов по отношению к энергии естественного белка будут подчиняться правилу аддитивности и, следовательно, отвечать представлению общей энергии в виде суммы парциальных энергетических вкладов атомных групп, значения которых не зависят от места мутации и природы боковой цепи. Ситуация здесь в принципе аналогична той, которая в свое время сложилась при попытке представить молекулярную рефракцию как аддитивную сумму рефракций отдельных атомных групп. Эксперимент подтвердил реальность такого представления.
