Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Для количественной характеристики структурных изменений в процессах свертывания и развертывания белковой цепи дикого и мутантного типов Фершт и соавт. [113, 130] ввели специальный параметр ф, близкий по смысловому значению параметру (3 в уравнении Бренстеда, связывающем константы равновесия (К) и скорости (к) реакции серии родственных по химическому строению соединений
Ink = const + (31nK,
где (3 — коэффициент Бренстеда, являющийся мерой подобия структуры переходного состояния структуре исходной молекулы. При сохранении в переходном состоянии расщепляемой связи (3 = 0, а при ее разрывае [3 = 1. Эквивалентной формой уравнения Бренстеда является соотношение
AG* = const + (3AGeq,
390
где AG* — энергия активации, AGeq — свободная энергия равновесного состояния. По отношению к двум родственным соединениям уравнение Бренстеда может быть записано в упрощенной форме
а _AAG*
Р AAGeq'
А. Фершт и сотрудники предположили, что зависимость между константами равновесия и константами скорости реакции свертывания нативного белка и белка, мутированного описанным выше способом, сходна уравнению Бренстеда, и поэтому ввели аналогичный {3 параметр ф, определяемый из соотношений разностей свободной энергии промежуточных, переходных и свернутых состояний аминокислотных последовательностей нативного и мутантного белков:
AAGi ^ AAG*
Значения ф для денатурации и ренатурации связаны между собой простой зависимостью:
Фн = 1 - ф0.
Интерпретация значений параметра ф более сложна, чем интерпретация (3, из-за нелинейной зависимости свободной энергии рассматриваемых состояний свертываемых белковых цепей. Имеются лишь две ситуации: ф = 0 и ф = 1, при которых параметр ф трактуется однозначно и совпадает с коэффициентом Бренстеда. Значение фм = О (случай ренатурации) показывает, что структура аминокислотной последовательности в месте мутации нативного белка и его аналога находится в полностью развернутом состоянии, а фи = 1 — полностью свернутом (при денатурации наоборот). Промежуточные значения ф свидетельствуют о частичном свертывании или частичном развертывании белковой цепи.
Для оценки вклада в термодинамику и кинетику процесса невалентных взаимодействий между двумя конкретными боковыми цепями (X и Y) Ферштом и соавт. [134—136] предложен метод так называемого двойного мутантного цикла. Он требует исследования, наряду с нативным белком Е—XY, трех его мутантов Е—X, Е—Y и Е, образующих циклическую систему, представленную на рис. Ш.16. При соблюдении требований, сформулированных для мутантов с одиночными заменами, двойной мутантный цикл позволит определить свободную энергию парных взаимодействий боковых цепей, используя соотношение
AAGXy = AGe_xy — (A GRX + AGg_y) + AG p.
Переходя от AAGXy к параметру ф, можно по значению последнего выяснить влияние невалентных взаимодействий X с Y на ход процесса. Разработанный Ферштом и соавт. [137—141] подход к изучению термодинамических и кинетических аспектов свертывания белковой
391
цепи с привлечением сайт-направленного мутагенеза позволил впервые в научной практике последовательно проанализировать все этапы формирования трехмерной структуры белка (барназы), не содержащего дисульфидных связей. Рассмотрение цикла работ о барназе предварим кратким описанием принципиальной схемы такого рода исследований.
1. Изучение обратимой денатурации начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания белковой цепи.
2. Модификация потенциально важных для денатурации меж-остаточных взаимодействий путем соответствующих изменений боковых цепей актуальных остатков и сайт-направленного мутагенеза. Составление оптимального набора мутантов и их синтез методами генетической инженерии.
3. Термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурации (денатурации) нативного белка и мутантов; определение констант равновесия и скорости процессов; расчет изменений свободной энергии стабильных структур, промежуточных и переходных состояний; построение энергетических профилей путем свертывания белковых цепей дикого и мутантного типов.
4. Построение разностных энергетических диаграмм, показывающих различия в уровнях энергии всех состояний на пути свертывания нативного белка и мутантов.
Реализация процедуры приводит к выяснению эмпирических зависимостей между важными для свертывания белковой цепи взаимодействиями боковых цепей и параметрами, характеризующими кинетику, равновесное состояние и механизм ренатурации. Каждая мутация, которая в рассматриваемом методе отличается от дикого типа одной атомной группой у одного аминокислотного остатка, позволяет количественно оценить ее парциальное воздействие на скорость свертывания и стабильность трехмерной структуры.
