Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
ную пластинку грузом. Буфер, поднимающийся из кюветы через гель к сухой фильтровальной бумаге, за 1—2 ч при комнатной температуре вымывает основную массу белка из геля. Нужный белок задерживается на афинном сорбенте, остальные же уходят дальше, в фильтровальную бумагу.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ БЕЛКОВ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПААГ
Аппаратура, сцинтилляторы, различные методы счета радиоактивности белков, а также способы оценки эффективности этих методов требуют отдельного подробного рассмотрения. Ниже в очень сжатом виде будут описаны только некоторые приемы оценки радиоактивности белков после их электрофореза в ПААГ.
Счет радиоактивность: в элюатах белка
Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с помощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует помнить, что злюция белка из геля никогда не бывает полной, поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля при таком подходе носит более или менее приближенный характер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением белкового раствора.
Один из специфических вариантов счета радиоактивности элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового препарата. В нем используется способность комплекса белок— ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным раствором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на нитроцеллюлозных^фшГьтрах"типа_«МППроге НА». К элюату белка в 1%-ном растворе ДДС-Na с (ГМ мочевиной добавляют в качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентрации 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ. Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. После этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Использование фильтра типа «Millipore» здесь обязательно, так как в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комплексов белок — ДДС-iNa не задерживаются [Buisson et al., 1976].
Для качественного определения радиоактивности “С и 1251 белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм) можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из стекловолокнистых фильтров типа «Whatman GF» или даже на бумажном фильтре «Whatman N 1». Сушить достаточно 30 мин при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивности ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].
Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C включает диффузию' нефиксированных комдйексов белок—ДДС-Na из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные 10%-ным раствором NH4OH. Диффузия идет в течение суток при комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всегда при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молекулярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].
Растворение ПААГ
Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при повышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода. Если белки мечены 14С, то к раствору Н202 следует добавить NH4OH до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный “СО*. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в такой смеси при 65® в течение 4—6 ч и далее просчитывать радиоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а возможность артефактов — тушения и хемолюминесценции — выше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного растворения геля в Н2Ог с NHtOH иногда предпочитают использовать один из фирменных «солюбилизаторов» и считать радиоактивность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Mat-zura, 1971]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в 30%-ной Н202 с 5% NH*OH (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтиллятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под названием «Aquasol». Для подавления хемолюминесценции щелочного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ледяной уксусной кислоты.
Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солюбилизаторов. Так, «Soluene» фирмы «Packard» растворяет ПААГ в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60— 65°. В солюбилизаторе NCS фирмы «Nuclear Chicago» при аналогичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN («New England Nuclear») рекомендует для обработки ПААГ использовать 3%-ный раствор солюбилизатора «Protosol» в сцинтилляцион-ной смеси под названием «Econofluor». За ночь при 37° гель набухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец, недавно был предложен специальный «коктейль», содержащий 6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл «Hyamine 10Х hydroxide» в 1 л толуола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной температуре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка |А1оуо, 1979].
