Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 50

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 130 >> Следующая

Тщательное сопоставление всех перечисленных выше методов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилуч-
шие результаты, по данным автора, дает обработка предварительно растертого геля в течение ночи при комнатной температуре 1%-ным раствором солюбилизатора «Soluene 350» в толуоле, содержащим 0,5% НПО и 0,05% вторичного сцинтиллятора MSB фирмы «Packard*. Для ускорения процесса можно предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл «Soluene 350» при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития составляет около 60%, а выход достигает 90—95%.
Полное растворение геля легко осуществить в том случае, когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В главе 1 уже был назван в этом качестве Nlsr-диаллилтартардиамид (ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте растворимого геля используют ЫЫ'-(1,2-диоксиэтилен)-бисакри-ламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ* при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O’Connel, Brady, 1976] утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более воспроизводимыми характеристиками, чем при использовании ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилил-цистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида [Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в p-меркаптоэтаноле за 2—3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тонкостей, которые необходимо учитывать во избежание образования дополнительных, устойчивых к воздействию р-меркаптоэта-нола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN'-Бисакрилилцистамин в настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и ЦОЭБА.
Несмотря на свою кажущуюся привлекательность растворимые ПААГ не получили широкого распространения — скорее всего, ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень легко — простым нагреванием — расплавляются гели агарозы, но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отложить до следующей главы.
Импрегнирование сцинтиллятора в гель
Возможен и обратный подход к решению проблемы счета радиоактивности белка после электрофореза — вместо элюции белка можно попытаться импрегнировать сцинтиллятор в кусочек геля, заменив им водное окружение радиоактивного белка и сохранив при этом прозрачность геля. Такая попытка реальна. В одном из описанных вариантов ПААГ дегидратируют в абсолютном этаноле, потом этанол заменяют на толуол, а его — на толуол-тритоновый сцинтиллятор [Gezelins, 1977]. По-видимому, лучше начинать с замены воды в геле на диметилсульфоксид.
При этом гель не будет съеживаться и тешйъ прозрачность, как это происходит при вымачивании его в этайоле.
Во всех случаях, когда обработке геДя предшествует его разрезание, следует стремиться к тому, чтббы в одном кусочке геля была вырезана целая полоса или вс^ белковое пятно. Широко распространенная практика разрезания цилиндрика геля на одинаковые диски толщиной 1—1,5 /мм неудачна, так как разрез «вслепую» может попасть на середину полосы. В результате этого радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в двойном объеме геля, что даст ложную картину вдвое более широкого и низкого пика ра^йоактивности на электрофореграмме.
Разумеется, для того -чтобы правильно вырезать белковую полосу, ее надо окрасить, а это трудно сделать при малой концентрации белка в полосе, что нередко имеет место при фракционировании радиоактивно меченных белков. Однако разработка новых высокочувствительных методов окрашивания белков,, например серебром, поможет решить эту проблему.
Авторадиография
Регистрацию полос радиоактивных белков в пластине г.еля можно осуществить методом авторадиографии. На гель накладывают рентгеновскую пленку и экспонируют ее в течение длительного времени в темноте, обычно при комнатной температуре. Экспозицию ведут в кассете, где пленка прижимается к гелю пружинами через резиновую прокладку. В зависимости от уровня радиоактивности белков экспозиция может длиться от нескольких часов до многих дней. Затем пленку проявляют обычными проявителями, предназначенными для получения максимально контрастного изображения. Под действием р-излучения участки пленки, лежавшие над белковыми полосами и пятнами, чернеют. Авторадиографию имеет смысл проводить только в тех случаях, когда белки мечены радиоактивным углеродом или йодом. Энергия излучения трития слишком мала, чтобы испускаемые им р-частицы смогли преодолеть воздушный промежуток между гелем и пленкой, да и просто вылететь из пластины, ввиду их сильного поглощения в геле.
Потеря энергии р-частиц в геле достаточно велика и в случае использования радиоактивного углерода, поэтому перед авторадиографией гель высушивают. Кстати, толщина высушенного геля будет тем меньше, чем меньше содержание в нем ме-тиленбисакриламида. Для высушивания гель переносят на фильтровальную бумагу («Whatman ЗММ»), под нее подклады-вают пористую прокладку и перфорированную металлическую пластинку. Все это помещают в полиэтиленовый мешок и присоединяют к вакуумному насосу. При подогревании в горячей воде или под лампой гель высыхает за 1—2 ч, образуя тонкую прочную пленку на поверхности фильтровальной бумаги. Есть множество фирменных устройств для сушки гелей. В них пласти-
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed