Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 44

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 130 >> Следующая

Чувствительность метода столь же высока, как и у ранее описанных методов окраски, серебром, но процедура существенно проще, дешевле и занимает всего 1 ч [Merril et al., 1981].
Данзилхлорид выпускается в виде двух кристаллических форм: кристаллы красного цвета плавятся при 70°, желтые — при 73°. Они хорошо растворяются в ацетоне. Максимум их поглощения в растворе лежит в области 330—360 нм, флюоресценции — 510 нм. Молярная экстинкция ?—4,3- 10е.
В щелочной среде, отщепляя ион хлора, данзильный остаток присоединяется к аминокислотам, пептидам и белкам, главным образом, по их концевой аминогруппе. При этом его способность флюоресцировать сохраняется.
Флюоресцентные красители
SOjCi
Данзилхлорид
4 Л. А. Остермвн
07
Данзилирование белков и пептидов позволяет следить за ходом их миграции при электрофорезе путем освещения гелей длинноволновым ультрафиолетовым светом, достаточно хорошо проникающим через пирексовое стекло. Скорость миграции белков при данзилировании практически не изменяется, поэтому небольшие примеси данзилированных препаратов можно использовать в качестве маркеров при разделении неокрашенных белковых смесей.
Данзилирование не мешает протеолизу белка, что позволяет проводить пептидный анализ данзилированных белков после их разделения электрофорезом в ПААГ и элюции из геля. При этом удается обнаруживать по флюоресценции не только концевые, но и внутренние пептиды. Дело в том, что данзилирование, хотя и намного менее эффективно, чем по концевым аминогруппам, происходит (в порядке ослабления) по SH- и ОН-группам цис-теина и тирозина, е-ЫН2-группам лизина и по гистидину. Ценным является то обстоятельство, что автолиз неданзилирован-ных протеаз не создает никаких помех при картировании пептидов.
Недавно описано данзилирование белков для последующего разделения ступенчатым электрофорезом в комплексе с ДДС-Na (в системе Лэммли) [Tijssen, Kurstak, 1979]. Белки растворяют до концентрации 2 мг/мл в 0,1 М Трис-ацетатном буфере (pH 8,2) с 10% ДДС-Na, добавляют ‘/is объема 10%-ного раствора данзилхлорида в ацетоне и, закрыв пробирку парафильмом, инкубируют в течение 15 мин на водяной бане при 50°. Свободный данзилхлорид нерастворим в водном ацетоне и образует мутножелтую суспензию, тем не менее данзилирование в ней происходит. Раствор просветляется после добавления ‘Дв объема р-мер-каптоэтанола и дополнительной инкубации .в течение 15 мин. Меркаптоэтанол связывает и растворяет избыток данзилхлорида.
Инкубационную смесь можно без дальнейшей очистки подвергать электрофорезу. Ярко люминесцирующие побочные продукты данзилирования быстро отделяются от белков и уходят вперед. В работе описан и препаративный вариант разделения белков под контролем данзилированных аликвот. При этом используется электрофоретическая элюция белковых полос из геля. Описан также пептидный анализ разделенных белков электрофорезом в системе Лэммли с градиентом пористости рабочего геля. Несколько ранее препаративный электрофорез белков под контролем данзилированных аликвот был описан Стефенсом [Stephens, 1975].
Флюоресцамин (иногда поставляется под фирменным наименованием «Fluram»), — желтовато-белый порошок, хорошо растворимый в ацетоне, диметильсульфоксиде и ацетонитриле. Хранить раствор следует не более двух недель: он неустойчив, особенно при рН<4 и рН>10. При взаимодействии с первичными аминами (концевыми аминогруппами, e-NHj-группами лизина)
е водной среде флюоресцамин дает сильно флюоресцирующие продукты в соответствии с представленной ниже схемой.
Флуоресцамин Амин Флуоресцирующий продукт
Реакция идет успешнее в щелочной среде. Продукт реакции имеет два максимума поглощения (при 300 и 390 нм) и максимум флюоресценции при 480 нм. Замечательно, что ни сам флюоресцамин, ни продукты его распада в растворе не флюоресцируют. При окрашивании белков и пептидов флюоресцамином не создается флюоресцирующего фона и окрашенный продукт можно не отделять от красителя, что чрезвычайно удобно. При использовании флюоресцамина для окраски белков или пептидов перед электрофорезом следует иметь в виду, что он вносит дополнительный отрицательный заряд (за счет образующегося карбоксила) и этим изменяет электрофоретическую подвижность окрашенного белка. В случае разделения белков, обработанных ДДС-Na, этот единичный заряд практической роли не играет.
В недавней работе [Jackowski, Liew, 1980] флюоресцамин использовали для окраски белков после их двумерного фракционирования «лектрофокуси-ровкой и электрофорезом по методу О’Фаррела. Белки фиксировали в пластине геля, вымачивая ее в течение ночи в 10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола (одновременно вымывались амфолины, которые окрашиваются флюоресцамином). Гель споласкивали в 7%-ной уксусной кислоте, помещали на 1 ч в диметилсульфоксид (ДМСО) и на 2 ч — в 0,04 М раствор борной кислоты в ДМСО, титрованный NaOH до pH ,10. Затем добавляли равный объем раствора флюоресцамина (0,5 мг/мл) в ДМСО и встряхивали смесь в течение 8 ч. Белковые пятна проявлялись уже через 2 ч. Их фотографировали при освещении длинноволновым ультрафиолетовым светом.
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed