Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Кстати, можно просто заполнить сефадексом вертикальную колонку и использовать его в качестве антиконвекционной среды для препаративного электрофореза белков. Это, конечно, уже не электрофорез в геле, и качество фракционирования будет эаве-
домо хуже, но для грубого разделения смеси белков оно может быть вполне приемлемым.
Отметим также успешное фракционирование до 1 г белковой смеси электрофорезом в градиенте концентрации раствора сахарозы (10—45%) в буфере с pH 8,5. Электрофорез вели в цилиндре диаметром 12 см и высотой 17 см [Walters, Bont, 1979]. Тонкость метода — в наслаивании препарата на раствор сахарозы с помощью металлического сита, которое поднимается по мере увеличения объема препарата, оставаясь сцепленным с мениском жидкости силами поверхностного натяжения. Это позволяет на-
Рис. 30. Схема злектрофоретиче-ской^элюции белков из геля в се-фадекс [Judd, 1979]
1 — полоски, вырезанные из геля; 2 — сефадекс Г-25 «суперфайн»; 3 —угольные электроды; 4 — смоченная буфером фильтровальная бумага
нести 30 мл исходного белкового препарата совершенно ровным слоем толщиной 3 мм. Электрофорез во избежание разогрева жидкости ведут при малой плотности тока (0,2 мА/смг) в течение 15 ч. Фракции собирают, сливая содержимое колонки через воронку, расположенную в ее нижней части. Препаративный электрофорез в 5—25%-ном градиенте сахарозы в 0,1 М Трис-боратном буфере (pH 8) с 6 М мочевиной был недавно использован для очистки фотохимически сшитого комплекса тРНК и тРНК-синтетазы [Renaud et al., 1979].
К электрофорезу в геле эти методы, разумеется, прямого отношения не имеют, так как являются примерами электрофореза в свободной жидкости. Именно с этого начиналось применение электрофореза для фракционирования биополимеров. Однако за последнее десятилетие, во всяком случае для аналитических целей, электрофорез в свободной жидкости был полностью вытеснен электрофорезом в гелях или на твердых носителях (бумаге, различных производных целлюлозы, полиамидных пленках и т. д.), который широко применялся при фракционировании пептидов, аминокислот и других сравнительно низкомолекулярных биологически важных молекул, в том числе и в высоковольтных вариантах. В свое время, например, очень важную роль сыграл метод фракционирования олигонуклеотидов гидролизата РНК двумерным электрофорезом. В первом направлении разделение вели на полосках ацетатцеллюлозы в пиридин-ацетатном буфере (pH 3,5) с добавлением 7 М мочевины, во втором — на ДЭАЭ-бумаге в 7%-ной НСООН [Brownlee, 1972]. Ввиду малой емкости ацетатцеллюлозы общая загрузка не превышала 0,1 мг гидролизата РНК, поэтому использовали препараты, меченные радиоактивным фосфором.
Сейчас методы фракционирования низкомолекулйрных биологических объектов электрофорезом на твердых носителях настолько энергично и успешно вытесняет жидкостная хроматография под высоким давлением (ЖХВД), что рассматривать их уже не имеет смысла. Впрочем, изредка электрофорез на твердом носителе еще используют и для фракционирования белков. Так, сравнительно недавно было описано очень -хорошее разделение девяти модификаций казеина молока электрофорезом на полосках ацетатцеллюлозы. Эти модификации различались уровнем фосфорилирования белка, и разделение шло по величине электрического заряда [West, Towers. 1976].
Глава 4
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
ЗАМЕЧАНИЯ ОБЩЕГО ХАРАКТЕРА
Фракционирование нуклеиновых кислот и их фрагментов электрофорезом в ПААГ и гелях агарозы отличается от фракционирования белков некоторыми характерными особенностями, вытекающими из различия природы этих биополимеров. Главное, что отличает нуклеиновые кислоты,— это неизменно отрицательный и значительный по величине суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты. Величина этого заряда мало зависит от pH окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому в подавляющем большинстве случаев фракционирование их при электрофорезе идет за счет различия размеров молекул, а ,не их зарядов.
Выбор буфера геля и напряженности электрического поля
Выбор буфера геля в описанной выше ситуации не играет существенной роли. Неудивительно, что ассортимент буферов, традиционно используемых в обычных, неденатурирующих условиях электрофореза нуклеиновых кислот, очень ограничен. Как для ПААГ, так и для гелей агарозы чаще других используют предложенный еще в 1968 г. 0,089 М Трис-боратный буфер Г Peacock. Dingman, 1968]. Для приготовления его в 10-кратной концентрации на 1 л конечного раствора берут 108 г Триса и 55 г борной кислоты. Иногда такой же буфер используют в концентрации 0,05 М. Нередко используют Трис-фосфатный буфер, pH 7,7 (0,036 М Трис+0,03 М NaHsP04) и Трис-ацетатный с добавлением ацетата натрия (0,05 М Трис-ацетат, pH 8,3+0,04 М
CH3COONa). Иногда используют также 0,025 М Na-веронало-вый (pH 8,7), 0,05 М Ыа-фосфатный (pH 7) и некоторые другие буферы.
Для разделения коротких олигонуклеотидов удается использовать и вклад заряда их оснований. При кислых значениях pH этот вклад может быть заметным и зависеть от нуклеотидного состава полимера. С этой целью употребляют, например, 0,025 М Na-цитрэтный буфер, pH 3,5.
