Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 53

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 47 48 49 50 51 52 < 53 > 54 55 56 57 58 59 .. 130 >> Следующая

нии ряда белков с молекулярными массами 100—500 тыс. при загрузке в гель 4 мг белка [Hardman, Капе, 1980].
Из-за его оригинальности стоит упомянуть об одном решении проблемы камеры элюции [Marceau et al., 1975]. ПААГ полиме-ризуют в цилиндре из плексигласа, закрытом внизу диализной мембраной, лежащей на пористой подложке. Над самой мембраной в цилиндр открываются отверстия двух трубочек. Одна из них используется для подкачки, вторая — для слива элюирующего буфера. ПААГ не прилипает к плексигласу, и весь столб геля может перемещаться вверх внутри цилиндра. Такое перемещение на очень малое расстояние вызывается кратковременной подкачкой буфера под гель при закрытом сливе. Так создается камера элюции: она существует только то время, которое необходимо для выхода в нее очередной полосы белка. Затем открывают кран трубочки для слива буфера. Гель под действием собственного веса оседает, и камера полностью опоражнивается. Процесс повторяют либо регулярно, по заданной программе, либо при подходе к нижнему концу геля очередной окрашенной маркером белковой полосы. Перед опорожнением камеры полярность напряжения на несколько секунд сменяют на обратную, что помогает десорбции белков с мембраны.
Проще и надежнее вести элюцию заранее окрашенных белковых полос последовательно, одну за другой, в сменные диализные мешочки [Sun, Hall, 1974]. В цитируемой работе ПААГ по-лимеризовали тоже в цилиндре из плексигласа диаметром 3 см, по оси которого проходила трубка для дополнительного охлаждения геля циркулирующей водой. Гель высотой 21 см поддерживался снизу найлоновой сеткой. Сменные диализные мешочки легко одевались на нижний конец цилиндра с помощью полиэтиленовых переходников. Перед снятием очередного мешочка полярность напряжения на короткое время реверсировали. Таким образом авторам удалось выделить из 6 мг исходного белкового препарата три компонента, относительно мало различающиеся между собой по молекулярной массе (43, 47 и 53 тыс. дальтон).
Возможно построить препаративную систему электрофореза с последовательной элюцией белковых полос с нижнего края пластины ПААГ. Фирма «Bio-Rad» предлагает для этой цели специальные прокладки, используемые при полимеризации геля. Конструкция прокладок позволяет подвести к нижнему краю рабочего геля толщиной до 6-мм по обеим его сторонам две трубочки, через которые потом и осуществляют элюцию белков. Сначала между стеклянными пластинками формы полимеризуют пробку из плотного ПААГ, затем, как раз на уровне трубочек-ги на высоту их диаметра, заливают слой раствора сахарозы, а над этим слоем уже полимеризуют рабочий гель. Сахарозу потом замещает элюирующий буфер.
Для препаративного фракционирования белков нередко используют систему ступенчатого электрофореза, хотя иной раз и
из несколько других соображений, чем с^дание узкой начальной полосы. Наличие дополнительного формирующего геля при большой загрузке предохраняет от преципитации белка на границе рабочего геля, позволяет увеличить объем препарата, обеспечивает удаление из него остатков соли до начала процесса рабочего разделения и, наконец, снимает необходимость преэлек-трофореза, так как основная часть персульфата успевает уйти из рабочего геля к аноду до того, как в этот гель вступают белки. Максимальная загрузка ПААГ при препаративном фракционировании белков может достигать 5 мг на 1 см2 сечения геля.
Общим недостатком любых устройств с последовательной элюцией белков в конце пути их миграции через весь гель является продолжительность этого процесса и, в силу этого, диффузия белковых зон (особенно для белков, выходящих последними), поэтому сейчас на практике отдают предпочтение обычному (хотя н с увеличенной загрузкой) фракционированию белков в трубках диаметром до 1,7 см или в толстых пластинах. Фракционирование ведут с примесью окрашенных «свидетелей», как было описано выше. Аликвоту разделяемой смеси белков окрашивают ремазолом [Sun, Hall, 1974] или посредством данзилирования [Tijssen, Kurstak, 1979; Schetters, McLeod, 1979]; окрашенные полосы вырезают и белки элюируют из геля за счет диффузии или электрофореза (см. выше).
Следует иметь в виду, что при элюции белков из геля может выходить большое количество линейного полиакриламида, не вошедшего в состав матрицы геля. Он не обнаруживается при оценке чистоты белка аналитическим электрофорезом. Между тем аналитическое ультрацентрифугирование показывает, что количество элюированного полиакриламида может быть таким же, как и самого белка. Дополнительную очистку белка в этом случае можно провести его сорбцией на ионообменную смолу [Brooks, Sander, 1980].
Недавно был предложен оригинальный способ электрофоретической элюции белков одновременно из нескольких полос геля, вырезанных из пластины после препаративного электрофореза [Judd, 1979]. На прямоугольный поднос наносят ровный слой пропитанного буфером сефадекса Г-25 «суперфайн» толщиной 2—3 мм. С интервалом в 1—1,5 см перпендикулярно длинной стороне подноса в сефадексе выскребают канавки, куда укладывают полоски геля (рис. 30). По концам подноса на сефадекс через смоченную буфером фильтровальную бумагу кладут угольные электроды и подают напряжение. Под действием электрического поля белки из каждой полоски геля мигрируют в прилежащий слой сефадекса. Эти слои затем снимают, переносят в мик-роколонки и белки из них элюируют.
Предыдущая << 1 .. 47 48 49 50 51 52 < 53 > 54 55 56 57 58 59 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed